基于非標記定量法的三疣梭子蟹精子塞蛋白質組學研究

宣富君 ，何 杰，趙雪冰，嵇雅芹，劉千姿，鮑成滿，張春麗

(1.鹽城師范學院海洋與生物工程學院，江蘇鹽城 224002；2.江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室，鹽城師范學院，江蘇鹽城 224002；3.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021；4.華南農業大學海洋學院，廣東廣州 510642)

精子塞是交配過程中雄性個體在雌性生殖道中形成的一種障礙物，形式多樣，一般呈固態膠質狀[1]。它廣泛存在于動物界，包括線蟲[2]、昆蟲[3-4]、蜘蛛[5]、爬行類[6]和哺乳動物[7-8]等各大門類，通常被解釋為雌性在多次交配過程中雄性個體間競爭的結果[9]。然而，盡管距文獻第一次報道已有160 a[10]，但我們現在對精子塞的認識還十分有限，對它的起源問題[11-12]，大多數物種精子塞的成分、形成機制及功能問題均尚未明確[5，10]。闡明精子塞存在意義的最好途徑就是充分揭示它的組成成分和形成機制[8]。目前，物種間有關精子塞的研究仍以解剖學組織學為主[5，10，13]，而在分子生物學層面，僅少數物種涉及[14]。根據現有的報道，精子塞通常含有大量精液成分，形成則基本依賴于交配過程中所接受的精液蛋白[12，15-17]。根據同科鋸緣青蟹Scylla serrata 人工模擬精子塞的工作揭示三疣梭子蟹Portunus trituberculatus 的這種精子塞至少部分可由雄性精液和雌性分泌物共同作用的產物組成[17]，而目前國內外關于這類精子塞的組成成分、形成機制及相關功能，尤其是梭子蟹這種可能基于兩性分子間的功能機制研究并不多見，基本還處于空白[14]。

生物大分子質譜技術和生物信息學分析的發展為蛋白質組學研究提供了有力的技術支持，質譜已成為蛋白質鑒定與定量的重要工具[18-19]。基于質譜的非標記定量檢測方法已應用于臨床樣本比對、實驗室生物信號通路研究等各個方面[20-21]。利用基于質譜的非標記定量技術進行蛋白質組定量的方法優勢明顯：①靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；②分離能力強：可分離出酸/堿性蛋白，小于10 KD 或大于200 KD 的蛋白、難溶性蛋白等；③適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質進行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等；④減少了前處理過程中的樣品損失，在肽段的檢測和蛋白質覆蓋率方面具有優勢；⑤采用單個樣品單獨分析，不受樣品來源和數目的限制；⑥方便與蛋白質絕對定量技術相結合，對生物體系中表達蛋白質絕對含量進行測定；⑦自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。

三疣梭子蟹是我國重要的海洋經濟蟹類，近98%的天然資源分布在我國的大陸架上，2015-2016年海捕量穩定在55 萬t 左右[22]。本研究旨在運用基于質譜的非標記定量的方法，分析三疣梭子蟹交配活動所形成精子塞的蛋白質組成，鑒定精子塞形成可能的關鍵蛋白，為進一步探討精子塞的形成與功能機制及后期人工授精等相關工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗于2015年9月10 日從浙江舟山養殖基地選取健康且未交配的成熟雄蟹25 只(頭胸甲寬135～150 mm；硬殼，處于蛻殼間期C)，待交配雌蟹25 只(頭胸甲寬110～130 mm；硬殼，游泳足倒數第二關節邊緣出現血絲，處于蛻殼前期D1-D2)，分別暫養于實驗室兩個長寬高為3 m×3 m×1 m 的水泥池內需。選擇標準參照宣富君等[11]三疣梭子蟹生殖蛻殼及交配行為的觀察研究。

待熟悉室內養殖環境(至少1 周)，選取其中12 對健康雌(游泳足倒數第二關節邊緣出現明顯紅色月牙，處于蛻殼前期D3-D4)雄個體并移入實驗室定制的12 只長寬高為0.5 m×0.5 m×0.5 m 的玻璃缸內進行配對實驗。期間，利用紅外線攝像對其交配行為進行實時監控，并適時解剖交配后的雌蟹獲取完整精子塞；將所獲完整精子塞分為上下兩部分-80℃低溫保存，其中4 個精子塞的上下部分送上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司測序，結果用于本文精子塞蛋白成分的比較分析。實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

高校液相色譜儀(Waters，USA)，色譜分離90 min (A：0.1% 甲酸，B：ACN，0.1%甲酸，流速：300 nL·min-1，柱溫：40℃)。質譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)，MS 掃描范圍(m/z) 300～1 200，質譜分辨率70 K。數據采集軟件：Thermo Scientific Proteome Discoverer softwareversion 1.4。反相柱信息：Thermo Scientific Acclaim PepMap C18 column (100 μm×2 cm，3 μm particle size)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品蛋白提取

取樣本液氮研磨。加入裂解液(7 M 尿素，2 M 硫脲，0.1% PMSF，65 m MDTT)裂解樣品。冰浴超聲，超聲條件為70～75 W，超聲5 s 停10 s，超聲3～5 min，冰上放置40 min。離心30 min (14 000 r·min-1、4℃)，取上清。按照體積比(樣品：丙酮為1 :5)向樣品中加入預冷的丙酮，離心20 min (14 000 r·min-1、4℃)，棄上清。待殘余的丙酮揮干后向樣品管中加入1 mL 裂解液復溶沉淀，備用。

1.3.2 還原烷基化和酶解

取出需要的樣本量加入終濃度10 mM DTT，在56℃下反應30 min 后加入終濃度20 mM IAA，室溫下避光反應30 min。每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比為5：1)，-20℃沉淀2 h。離心20 min(14 000 r·min-1，4℃)，取沉淀。用含1 M 尿素的TEAB 溶解液20 μL，混懸，充分溶解樣品。取樣品置于2 mL 超濾離心管，4℃下10 000 g 離心3 min，反復至樣本完全超濾完成。按照質量比1:50 (酶：蛋白)加入Trypsin 在37℃酶解15 h。終止：酶解液加入終濃度0.5%的TFA 終止酶解，濃縮凍干。

1.3.3 Bradford 定量

準備BSA 標準品的標準曲線，8 個的標準品量(0.5 μg·μL-1BSA)依次為0，1，2，4，8，12，16，20 μL，向每管添加純水，使最終體積為20 μL。將樣品稀釋5 倍，每個樣品各取20 μL 至管中。向每管添加180 μL蛋白質分析反應劑，混合，室溫培養10 min。測量595 nm 下的吸光度，依據標準曲線計算出樣品濃度。

1.3.4 液相色譜-二級質譜聯用

參考YIN Xuefei，et al[23]的分析方法，樣品在高pH 反向色譜中分離，然后進入串聯質譜分析。

1.3.5 搜庫和數據分析

質譜原始數據采用Mascot 軟件比對uniprot 數據庫(https://www.uniprot.org/)，然后對鑒定到的蛋白進行GO 功能注釋和KEGG 通路分析。

2 結果與分析

2.1 數據定量分析

通過將得到的RNA-SEQ 數據庫匹配的2 680 張譜圖，85 個蛋白家族，Uniprot 數據庫匹配1 074 張譜圖，79 個蛋白家族使用PEAKS Label free quantitation 模塊進行非標記定量。以P＜0.05 且蛋白相對豐度＞1.2 或＜0.8 為質控標準，得到差異定量蛋白結果共22 個蛋白家族。

2.2 GO 分類結果分析

按照Uniprot 數據庫中各蛋白質的GO 注釋分別進行生物過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC)，分子功能(Molecular Function，MF)分類。由圖1 可知，共計生物學過程56 條，細胞組成45 條，分子功能29 條。差異表達蛋白主要來自于細胞、細胞組分、細胞器以及大分子復合物，以結合和催化活性功能為主，70%的蛋白質主要參與代謝、細胞以及單生物等生物學過程。通過對差異蛋白進行功能更細致的GO 的三級、四級分析可知，差異蛋白主要是定位于細胞內細胞器，發揮核苷結合、核苷酸結合、核苷磷酸結合、核酸結合、負離子結合、轉移酶活性、轉移含磷基團等分子功能，參與大、小分子代謝過程以及磷代謝過程等生物學過程。

圖1 差異蛋白的GO 二級分析結果圖Fig.1 GO analysis of differently expressed proteins at the 2nd level

2.3 KEGG 分析

KEGG 分析顯示的差異蛋白質可能參與的具體生物學通路前20 個條目(圖2、圖3)。三疣梭子蟹精子塞差異蛋白富集的主要信號通路有催產素信號通路，內質網蛋白加工，甲狀腺激素合成，甲狀腺激素信號通路等。對差異蛋白做KEGG 注釋，根據差異蛋白參與的KEGG 代謝通路進行分類，與代謝功能相關的Global and overview maps 通路，與有機系統相關的Immune system、Endocrine system，與環境信息處理相關的Signal transduction 通路，與遺傳信息處理相關的Folding，sorting and degradation 通路，與細胞過程相關的Transport and catabolism、Cell growth and death 通路對形成三疣梭子蟹精子塞關鍵蛋白具有重要意義。

2.4 表達差異分析

以P＜0.05 且(蛋白相對豐度差異倍數＜0.8 或＞1.2)為標準篩選顯著差異表達蛋白，針對兩兩分組的精子塞上下兩部分的差異表達蛋白進行GO 注釋的統計，結果顯示未發現蛋白表達水平上調，發現下調共計27 個蛋白表達水平顯著(圖4)。其中生物學過程共10個蛋白表達水平下調(生物調節1 個，細胞過程3 個，代謝過程3 個，生物過程調節1 個，應激反應1 個，單生物過程1 個)；細胞組分共9 個蛋白表達水平下調(細胞3 個，細胞區域3 個，大分子復合物1 個，細胞器2 個)；分子功能共8 個蛋白表達水平下調(結合5 個，催化活性3 個)。

3 討論

目前在研究嚙齒動物時對精子塞中有4種假設：(1)精子釋放假說：當精子塞解體時，允許精子在雌性生殖道內逐漸釋放；(2) 精子運輸假說：阻止精液在射精后流出陰道，或以其他方式促進精子通過子宮頸進入子宮；(3)交配刺激假說:促進交配刺激；(4)再次交配阻礙假說：阻止已經受精的雌性再被其他雄性受精[24]。每種功能假說均有相應證據支持，由于精子塞可能有助于交配刺激，這可能導致收縮，同時肌動蛋白對于細胞的收縮是必不可少。因此三疣梭子蟹蟹精子塞的關鍵蛋白可能包括肌動蛋白，這與我們的研究結果一致，所以我們的研究結果更支持交配刺激假說。

圖2 KEGG 分析結果(前20 條信號通路)Fig.2 KEGG pathway analysis of differently expressed proteins (top 20)

圖3 KEGG 注釋統計圖Fig.3 KEGG annotated statistical chart

圖4 上下調蛋白GO 注釋柱形圖Fig.4 GO annotated chart of up-down regulatory proteins

現有研究表明，精子塞通常含有大量精液成分，形成基本依賴于交配過程中所接受的精液蛋白[12，15-17]。例如，利用蛋白質組和RNA 干擾技術，ROGERS，et al[5]對瘧疾傳播者瘧蚊Anopheles gambiae 精子塞的形成進行了研究，結果表明該精子塞主要通過一種名為轉谷氨酰胺酶(雄性附腺前端分泌)的精液蛋白作用，使底物蛋白Plugin(另一種精液蛋白，富含谷氨酰胺殘基，由雄性附腺后端分泌)發生交聯反應凝聚而成。該機制與報道的有關哺乳動物精子塞的形成十分類似[25-26]，但后者相對復雜，以小鼠Mus musculus 為例，其精子塞形成可分為2 個階段：首先由其雄性生殖系統貯精囊分泌的具有自凝功能的底物蛋白SVSⅠ-Ⅲ發生自聚反應，形成以二硫鍵鏈接的高分子復合物HMWCs，隨即雄性小鼠前列腺會分泌出作用蛋白TGM4(也是一種轉谷氨酰胺酶，后者促使HMWCs 凝集，最終形成膠狀固態精子塞[10，12]。此外，精子塞也可能是雄性生殖系統不同部位分泌的不同精液蛋白在雌性生殖道內形成的多個部分組成，如果蠅Drosophila melanogaster 的精子塞[4]：它可分為前后兩個部分，前面主要由副性腺分泌的Acp36DE 蛋白組成，后面則是射精管球分泌的具自發熒光功能的PEB-me 蛋白，由于形成時間上的差異，精莢等遺傳物質主要集中在前面部分。這種結構與三疣梭子蟹的精子塞類似[13-14]，梭子蟹的精子塞也明顯主要由前后兩個部分組成，即頂部含大量精莢的雄性基質MM 和底部半透明部分TPSP[14]。與小鼠、瘧蚊不一樣，三疣梭子蟹精子塞的形成似乎與雌性分泌物有關，這與我們研究結果中三疣梭子蟹精子塞差異蛋白富集的主要信號通路是催產素信號通路相一致。因此，我們推測：梭子蟹科精子塞的形成很可能涉及一種基于兩性分子間作用的全新機制，即以雄性精液蛋白為底物蛋白，而雌性納精囊的分泌物為作用蛋白。

從非標記定量分析顯示的結果來看，三疣梭子蟹的精子塞上下部分中共有22 種蛋白家族的表達存在顯著差異，GO 功能分析結果顯示：差異蛋白主要參與代謝、細胞以及單生物等生物學過程；發揮結合和催化活性的分子功能；主要定位于細胞、細胞組分、細胞器以及大分子復合物。且KEGG 通路富集分析顯示：差異蛋白主要富集的信號通路是催產素信號通路和內質網蛋白加工。經過KEGG 注釋通路分析顯示精子塞中肌動蛋白，結合蛋白以及細胞內內質網腔的氧化還原酶(ERp57)等表達水平下調。肌動蛋白是真核生物中最豐富的蛋白質之一，分布于整個細胞中，能通過聚合形成微絲。肌動蛋白形成的微絲(F-肌動蛋白)是真核細胞骨架重要組成部分。在絕大多數真核細胞中，F-肌動蛋白形成大規模的網絡結構，這種結構對于細胞器的運動、形狀提供機械支持，并提供通過細胞質運輸的轉導信號等諸多功能[27]，除此以外，對細胞的凋亡、遷移和增殖等生物學功能也有著重要的影響。結合蛋白(Bip)在未折疊蛋白反應信號傳導通路中處于核心地位，被認為是未折疊蛋白反應的標志性分子，具有幫助錯誤折疊的蛋白恢復成正確折疊方式的作用。已有研究表明內質網中的蛋白質功能主要是監控蛋白質折疊是否正確，終末錯折疊的蛋白質與結合蛋白結合[28]，并通過蛋白酶體降解，結合蛋白表達水平的下調說明精子塞形成過程中，蛋白質正確折疊，蛋白質錯誤折疊率下降。已有報道證實ERp57 是一種存在于內質網中的分子伴侶，具有多種生物學功能，它能與不同的蛋白質折疊中間體相互作用，幫助多肽鏈的正確折疊和裝配[29]。在小鼠精子中，已證實ERp57 定位于精子赤道部，在精卵融合過程中起著重要的作用。2006年，ELLERMAN，et al[30]報道ERp57 定位于小鼠頂體反應后精子的赤道區，與精卵融合有關。隨后在人類精子的研究中也發現，ERp57 主要定位于精子的頂體和尾部，頂體反應后位于赤道部。猜測ERp57 有可能與三疣梭子蟹交配過程的精子頂體反應有關，ERp57 在精子塞形成過程中發揮重要作用。由此可知精子塞形成的關鍵蛋白為結合蛋白與肌動蛋白等，且與ERp57 存在密切聯系。通過三疣梭子蟹精子塞表達差異分析，差異蛋白在生物學過程、細胞組成以及分子功能均出現表達水平下調，且沒有表達水平上調，說明在精子塞形成過程中：生物調節，細胞過程，代謝過程，生物過程調節，應激反應，單生物過程等生物學過程會出現不同程度的增加；結合和催化活性同時也會提高；細胞、細胞區域、大分子復合物、細胞器等細胞組分增多。