皂角刺中總黃酮含量測(cè)定及其抗氧化活性研究*

宋忠興 ，唐志書(shū) ，嚴(yán)邑萍 ，史鑫波 ，劉妍如 ，趙 鵬

（1.陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 銅川 727031； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)·陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712046； 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

皂角刺又名皂莢刺、皂刺和天丁，為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，始載于《本草衍義補(bǔ)遺》，具有消腫托毒、排膿、殺蟲(chóng)、抗癌之功效，臨床常用于治療癰疽初起和膿成不潰[1]。皂角刺資源豐富，主產(chǎn)于我國(guó)河南、山東、陜西等地區(qū)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，皂角刺中含有黃酮類、萜類、甾體類、酚酸類等多種化學(xué)成分[2-3]，具有良好的抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-5]，但其化學(xué)成分與含量測(cè)定方面的研究很少，中國(guó)藥典也未對(duì)其提取方法和含量測(cè)定進(jìn)行規(guī)定。我國(guó)對(duì)皂角刺的研究主要在于化學(xué)成分和臨床藥理方面[6]，皂角刺中黃酮類成分為其抗腫瘤的主要活性成分，蘆丁則是其中的活性成分之一。為控制皂角刺質(zhì)量及研究其活性，本試驗(yàn)中以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，對(duì)皂角刺醇提物和水提物中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定[7-9]。同時(shí)，采用體外抗氧化方法對(duì)不同提取物進(jìn)行評(píng)價(jià)，為合理開(kāi)發(fā)皂角刺相關(guān)制劑及產(chǎn)品提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPD225D型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司）；FW-1000AD型高速粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥

皂角刺所用藥材采自陜西，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定為豆科植物皂莢Gleditsia sinensisLam.的干燥棘刺，藥材標(biāo)本存放于陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心；蘆丁對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)為wkq16101104，純度大于98%）；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為S0116）；試驗(yàn)用試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原藥材前處理

將皂角刺藥材放入烘箱60℃干燥3 h，取200 g粉碎，過(guò)3號(hào)篩，得皂角刺粗粉。干燥至恒重，冷卻，備用。

2.2 提取方法

2.2.1 回流提取法[10]

皂角刺加熱回流醇提物：稱取5.0 g（平行3組）藥粉，精密稱定，過(guò)3號(hào)篩，置250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇150 mL回流提取2 h，濾過(guò)，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶解，溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

皂角刺加熱回流水提物：操作同前，僅回流時(shí)所加液體由70%乙醇換為水。

2.2.2 超聲提取法[11]

皂角刺超聲醇提物：稱取5.0 g（平行3組）藥粉，精密稱定，過(guò)3號(hào)篩，置具塞錐形瓶中，加70%乙醇75 mL，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz，下同）處理30 min，濾過(guò)，殘?jiān)?0%乙醇75 mL，超聲處理30 min，合并濾液，濾液水浴蒸干，殘?jiān)苡?0%乙醇，將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

皂角刺超聲水提物：操作同前，僅超聲時(shí)所加液體由70%乙醇換為水。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液制備

取120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%乙醇10 mL，超聲溶解，加50%乙醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.22 g/L的對(duì)照品溶液。

2.3.2 最大吸收波長(zhǎng)選擇

精密量取對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL，搖勻，靜置 6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4mL，用50%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。置比色皿中，參照空白試劑，并在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，蘆丁在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm[7]。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液 0，0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 mL，其余操作同 2.3.2 項(xiàng)下“置比色皿中”前，以第一份作為空白對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[7]。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=13.912X-0.007 1，r=0.999 8（n=7）。結(jié) 果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.005 5～0.088 0 g/L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：日內(nèi)精密度，取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得吸光度的RSD為1.47%（n=6）；日間精密度，取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，按2.3.2項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得吸光度的RSD為0.96%（n=3）。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取皂角刺加熱回流水提物供試品溶液適量，于室溫下分別放置 0，10，20，30，40 min 時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果的RSD為2.00%（n=5），表明室溫下供試品溶液在40 min內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：另取同一批皂角刺藥材粉末6份，每份約5 g，按2.2項(xiàng)下回流水提物方法提取，依法測(cè)定。結(jié)果的RSD為1.33%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的皂角刺樣品6份，精密稱定，均分為3組，分別按樣品中黃酮含量80%，100%，120%的比例加入蘆丁對(duì)照品溶液，依法進(jìn)行樣品制備及含量測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.4 樣品含量測(cè)定

稱取皂角刺藥材粉末約5 g，精密稱定，依法進(jìn)行樣品制備及含量測(cè)定。結(jié)果不同提取物中總黃酮的含量有一定差異，總黃酮含量排序依次為超聲醇提物（1.38%）>回流醇提物（1.35%）>回流水提物（0.76%）>超聲水提物（0.33%），故可選擇總黃酮含量最高的超聲醇提法提取皂角刺總黃酮。

2.4 皂角刺總黃酮抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 溶液制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取27.8 mg總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒中的FeSO4-7H2O適量，以水溶解并定容至1 mL，此時(shí)濃度為 100 mol/L，以水稀釋至 0.15，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50 mmol/L。

FRAP工作液：按試劑盒中的試劑一∶試劑二∶試劑三（10 ∶1 ∶1，V/V/V）混勻充分，避光 37 ℃孵育，現(xiàn)用現(xiàn)配，2 h內(nèi)用完。

2.4.2 清除Fe3+活性測(cè)定

在96孔板中分別標(biāo)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔，加相應(yīng)溶液各5 μL，再分別加入FRAP工作液180 μL。37℃下孵育3～5 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為593 nm，記錄吸光度。空白孔測(cè)定1次，測(cè)定孔和標(biāo)準(zhǔn)孔分別作3組對(duì)照，每組測(cè)3次。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.275 4X+0.050 4（r=0.999 7）。按上述方程測(cè)定不同質(zhì)量濃度樣品吸光度，結(jié)果見(jiàn)表2。將上述各提取物樣本測(cè)得的吸光度代入線性方程，計(jì)算總抗氧化能力。

表2 不同質(zhì)量濃度樣品吸光度

水提物和醇提物對(duì)Fe3+的清除作用分析結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，皂角刺加熱回流水提物對(duì)Fe3+的清除作用較強(qiáng)，即總抗氧化能力最強(qiáng)。在總黃酮質(zhì)量濃度為0.1～0.3 g/L范圍內(nèi)，不同提取物還原能力與濃度呈正相關(guān)。不同提取物皂角刺總黃酮對(duì)Fe3+的還原能力排序?yàn)榛亓魉嵛?超聲水提物>回流醇提物>超聲醇提物。

圖1 不同提取物的總抗氧化能力趨勢(shì)圖

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于自然界各類植物中，具有多種生物活性[12]，為中藥重要的化學(xué)成分。目前測(cè)定總黃酮的方法以紫外-可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜（HPLC）法多見(jiàn)，本研究中采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定皂角刺中總黃酮含量，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、可靠，可作為皂角刺藥材中總黃酮含量的檢測(cè)方法。回流醇提物和超聲醇提物中總黃酮含量明顯高于相應(yīng)水提物。因此，建議在研究以黃酮為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí)，可以醇提物為主。

本研究結(jié)果顯示，不同方法和溶劑提取的皂角刺中總黃酮的含量差異明顯，但均有一定的抗氧化能力。FRAP為Fe3+還原抗氧化體系衡量總抗氧化能力指標(biāo)[13]，目前鮮有皂角刺總黃酮的體外抗氧化研究報(bào)道，但實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同提取物對(duì)Fe3+的還原能力與其總黃酮的含量并無(wú)量效關(guān)系。同時(shí)，水提物的抗氧化能力均大于醇提物，表明皂角刺的抗氧化能力與提取溶劑和總黃酮含量均相關(guān)，初步推測(cè)其抗氧化作用也可能與來(lái)自總黃酮中具體的黃酮種類有關(guān)，但要確定總黃酮物質(zhì)中哪種成分起到了抗氧化作用，還需要進(jìn)一步深入研究。相關(guān)研究顯示，其抗氧化活性物質(zhì)可能是總黃酮、酚酸類和萜類等。回流水提物的抗氧化活性最好，可將其作為下一步的研究重點(diǎn)。目前已開(kāi)展皂角刺中酚酸類和萜類等成分生物活性效應(yīng)評(píng)價(jià)[14]，以期早日將其應(yīng)用于臨床[15]。