正交試驗法優(yōu)選肺炎合劑提取工藝*

韋寶含，林小明，覃祖前，曾 毅，韋平原，李練忠

（廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院，廣西 貴港 537100）

肺炎合劑由麻黃、虎杖、白花蛇舌草、腫節(jié)風、魚腥草、金銀花等中藥組方，有清熱解毒、宣肺平喘、鎮(zhèn)咳化痰功效，常用于治療急慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病。方中麻黃、虎杖為主藥，麻黃主要成分為鹽酸麻黃堿，虎杖主要成分為虎杖苷[1]。本試驗中以鹽酸麻黃堿和虎杖苷含量及提取液濃縮的相對密度為評定指標，選擇加水量、浸泡時間、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，采用L9（34）正交試驗[2-4]，篩選肺炎合劑的最佳提取工藝。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SSI1500型高效液相色譜儀（美國Scientific Systems Inc）；FA-2004B型電子分析天平（上海景科甜美科學儀器有限公司）；VDR-20GU型減壓干燥器（韓國杰奧特有限公司）；XO-5200TDS型超聲波清洗器（武漢恒信世紀科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿對照品（批號為171241-201007）、虎杖苷對照品（批號為111575-200502），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（批號為2017090401）、乙腈（批號為2017081401）均為色譜純，購于成都市科隆化學品有限公司；磷酸（西隴化工股份有限公司，批號為130525 1）、二正丁胺（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20150603）、乙醇（成都市科隆化學品有限公司，批號為2017110201）均為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 鹽酸麻黃堿含量測定[5-9]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：極性乙醚連接苯基鍵合硅膠（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.092% 磷酸溶液（含 0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）-甲醇（98.5∶1.5）；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；室溫：28.3℃。

2.1.2 溶液制備

圖1 鹽酸麻黃堿含量測定高效液相色譜圖

取鹽酸麻黃堿對照品0.0284 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mL含284 μg的對照品溶液。按1/5處方量取藥材87.9 g，加8倍量水煎煮3次，每次煎煮2 h，濾過，合并濾液，濃縮至適量放冷后定容至200 mL，搖勻，即得供試品貯備液；精密量取 2 mL，置50 mL容量瓶中，用1.44%磷酸溶液定容，稱定質(zhì)量，超聲（功率為600 W，頻率為50 kHz）處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用1.44%磷酸溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備缺麻黃的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密量取2.1.2項下3種溶液各10 μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計應不低于3 000，陰性對照無干擾，詳見圖1。

線性關系考察：精密量取對照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.4，1.6 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）對樣品質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進行線性回歸，得回歸方程Y=9 284.2X+41 278，R2=0.999 7（n=6）。結果表明，鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度在4.5444～18.176μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣，依法測定鹽酸麻黃堿峰面積，平行操作6次。結果的RSD為0.261%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液，室溫下按2.1.1 項下色譜條件分別于 0，3，6，9，12，24 h 時依法進樣測定鹽酸麻黃堿峰面積。結果的RSD為0.262%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一供試品貯備液，按供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.1.1項下色譜條件依法進樣測定鹽酸麻黃堿的含量。結果平均含量為7.3267 μg/mL，RSD為0.75%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的供試品貯備液1 mL，共6份，每兩份為一組，分別精密加入對照品溶液 0.3，0.7，1.1 mL，混勻，依法制備試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣依法測定鹽酸麻黃堿含量，計算含量及回收率。結果見表1。

表1 鹽酸麻黃堿加樣回收試驗結果（n=6）

2.2 虎杖苷含量測定[10-14]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ODS 膠 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（23∶77，V/V）；檢測波長：306 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：45 ℃ ；室溫：26.5℃。

2.2.2 溶液制備

稱取經(jīng)五氧化二磷干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對照品0.004 0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容，搖勻，制成對照品溶液（質(zhì)量濃度為80 μg/mL）。按 1/5處方量取藥材 87.9 g，加 8倍量水煎煮3次，每次煎煮2 h，濾過，合并濾液，濃縮至適量，放冷后定容至200 mL，搖勻，即得供試品貯備液；精密量取2 mL置50 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備不含虎杖的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下3種溶液，按2.2.1項下色譜條件依法測定。結果理論板數(shù)按虎杖苷峰計應不低于3 000，陰性對照無干擾，詳見圖2。

線性關系考察：精密量取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻。按擬訂色譜條件依法測定，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進行線性回歸，得回歸方程Y=27 091X-2 312.8，R2=0.999 6（n=6）。結果表明，虎杖苷質(zhì)量濃度在4～24 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

圖2 虎杖苷含量測定高效液相色譜圖

精密度試驗：精密吸取對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件依法測定虎杖苷峰面積，平行操作6次。結果的RSD為0.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液，室溫下按擬訂2.2.1 項下色譜條件分別于 0，3，6，9，12，24 h 時進樣依法測定虎杖苷峰面積。結果的RSD為0.21%（n=6），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一供試品貯備液，按供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.2.1項下色譜條件進樣依法測定虎杖苷的含量。結果平均含量為17.1267 μg/mL，RSD為1.65%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的供試品貯備液1 mL共6份，每兩份為一組，分別精密加入對照品溶液（質(zhì)量濃度為 400 μg/mL）0.5，1.0，1.5 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣依法測定虎杖苷含量，計算含量及回收率。結果見表2。

表2 虎杖苷加樣回收試驗結果（n=6）

2.3 相對密度測定

按2015年版《中國藥典（四部）》相對密度測定法（通則0601）項下“比重瓶法”測定各樣品溶液的相對密度，結果見表3。

2.4 評分標準制訂

將相對密度（X）的考核滿分定為20分，鹽酸麻黃堿含量（Y）、虎杖苷含量（Z）的考核滿分均定為40分。即綜合評分計算公式為：總分=（Xi/Xmax）×20+（Yi/Ymax）×40+ （Zi/Zmax）×40（i介于 1～9）。

表 3 L9（34）正交試驗結果（n=9）

2.5 正交試驗優(yōu)選

因素與水平：選取加水量（A，倍）、浸泡時間（B，min）、提取時間（C，h）、提取次數(shù)（D，次）為考察因素，每個因素選取3個水平，見表4。

表4 正交試驗因素水平表

試驗設計與方法：稱取1/5處方量藥材，按表2、表 3正交試驗設計試驗。提取液過濾，合并提取液濃縮至適量，放冷后用水定容至200 mL，搖勻，即得9個試驗樣品溶液。依法測定鹽酸麻黃堿和虎杖苷含量及溶液相對密度。結果見表3。

結果分析：由表3直觀分析結果可知，各因素影響程度為 D>B>A>C，其中，因素 A：A3>A1>A2，因素 B：B3>B2>B1，因素 C：C3>C1>C2，因素 D：D3>D2>D1，因此選用提取工藝為A3B3C3D3。由表5方差分析結果可知，因素D對試驗結果有極顯著影響，因素B對試驗結果有顯著影響，因素A及因素C對試驗結果幾乎無影響。

表5 方差分析結果

最佳工藝確定：利用直觀分析法分析正交試驗結果后，由于所得最佳搭配只是相對于被選因素和水平而言，不是絕對的“最佳”，因此通常需作進一步討論，而這一點恰恰容易被研究人員忽視[15]。綜合表3和表5及從降低能源消耗和生產(chǎn)成本考慮，優(yōu)選提取工藝的最佳條件為A1B3C1D3，即加8倍量水，浸泡90/120 min，每次提取1 h，共提取3次，此為肺炎合劑的最佳提取工藝。

2.6 驗證試驗

按處方量比例平行稱取藥材3份，分別按A1B3C1D3提取工藝操作，依法測定鹽酸麻黃堿、虎杖苷的含量及溶液相對密度。結果見表6。可見，3份提取液的綜合評分分別為101.30，101.31，100.51分，均高于表3的最高評分。說明該提取工藝科學合理，穩(wěn)定可行。

表6 最佳提取工藝驗證試驗結果

3 討論

3.1 測定方法選擇

含量測定成分選擇：一般應根據(jù)制劑的功能主治或活性試驗結果來選擇相應的專屬性成分、活性成分作為含量測定指標，同時應首選樣品中原含成分，避免選用水解成分。當單一成分不能反映該藥的整體活性時，應采用多成分或多組分的檢測方法。麻黃和虎杖作為肺炎合劑主藥，鹽酸麻黃堿和虎杖苷作為主要成分，被2015年版《中國藥典（一部）》收載為麻黃和虎杖的定量指標，本研究中選擇鹽酸麻黃堿和虎杖苷作為定量指標具有重要意義。

流動相選擇：虎杖苷含量測定試驗中，比較了流動相為乙腈 -水（20 ∶80，V/V）、乙腈-水（23 ∶77，V/V）、乙腈-水（30∶70，V/V）時對分離結果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水（23∶77，V/V）的分離效果最好。鹽酸麻黃堿含量測定試驗中，比較了流動相為0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）-甲醇（98.5∶1.5，V/V）和（98 ∶2，V/V）對分離結果的影響，結果分離效果基本一致。

避光操作：試驗中發(fā)現(xiàn)，虎杖苷需在避光下操作，否則在光照條件下易分解，含量下降明顯[16-17]。

3.2 提取工藝選擇

加水量：加水量為8，10，12倍時，綜合評分（3個樣品之和，下同）分別為 206.06，187.59，225.40 分（P>0.05）。結果顯示，加水量在8～12倍之間時對制劑質(zhì)量影響甚微，但8倍加水量更節(jié)約資源，成本更低。因此，加水量選擇8倍。

浸泡時間：浸泡時間分別為30/60，60/90，90/120 min 時，綜合評分分別為 176.65，209.41，232.98 分（P<0.05）。結果表明，浸泡時間對制劑質(zhì)量有一定影響。故浸泡時間選擇綜合評分最高的B3，即浸泡時間選擇90/120 min。

提取時間：提取時間為1，1.5，2 h時，綜合評分分別為210.85，197.33，210.86分，說明提取時間在1～2 h范圍內(nèi)時對制劑質(zhì)量幾乎無影響，從節(jié)約能源和生產(chǎn)成本考慮，提取時間選擇1 h。

提取次數(shù)：提取次數(shù)分別為1，2，3次時，綜合評分分別為 143.90，219.52，255.62 分（P<0.05）。結果表明，提取次數(shù)對制劑質(zhì)量有顯著影響，在1～3次范圍內(nèi)提取次數(shù)越多，制劑有效成分含量越高，故提取次數(shù)選擇3次。

綜上所述，高效液相色譜法測定肺炎合劑提取液中鹽酸麻黃堿、虎杖苷的含量，專屬性強，操作簡便，結果準確，重復性好。最佳提取工藝條件為加水8倍，浸泡90/120 min，每次提取1 h，提取3次。此提取工藝經(jīng)驗證證明科學合理，穩(wěn)定可行。