高效液相色譜法測定3種劑型黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量*

王 謙，賴 慧，陳 立，李 建，米曉琴，趙福蘭

（西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科，四川 瀘州 646000）

中藥黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge. 或蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsio的干燥根，主要含皂苷類、氨基酸、多糖等成分。研究表明，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為黃芪的活性指標成分，故2015年版《中國藥典（一部）》以黃芪藥材中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量作為其質量評價指標[1]。中藥配方顆粒生產中均采用企業自擬標準，至今尚未形成國家統一的質量標準[2-3]。中藥最細粉是利用超微粉碎技術將藥物粉碎至粒徑小于50 μm，使動植物細胞膜破裂，顯著提高了有效成分的溶出度及其生物利用率[4]。本研究中采用高效液相色譜法測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，以評價黃芪飲片、最細粉和配方顆粒的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀、AUW120D型電子天平（日本島津公司）；Alltech 3300型蒸發光散射檢測器（ELSD，瑞士步琦公司）；BM1926型索氏提取器（成都寰宇鑫成特種玻璃有限公司）。

1.2 試藥

黃芪甲苷對照品（批號為 111920-201203）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號為119348-201432），均購自成都市食品藥品檢驗所；黃芪飲片（四川禾一天然藥業有限公司，批號為140901），黃芪配方顆粒（委托四川新綠色藥業科技發展股份有限公司加工，每袋1.4 g，相當于黃芪藥材10 g），黃芪最細粉（委托瀘州百草堂中藥飲片有限公司加工），3種劑型均為同一批次黃芪藥材制得；乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余制劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

黃芪甲苷：色譜柱為Kromasil100-5C18柱（150mm×4.6mm，5 μm）；流動相為乙腈 -水（32 ∶68，V/V）；柱溫為40℃；流速為1.0 mL/min；ELSD檢測器流動氣體壓力為 350 kPa；漂移管溫度為 45 ℃[1，5]。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：色譜柱為Kromasil 100-5 C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min時A為20%→40%，20～30 min時A為40%）；檢測波長為260 nm；柱溫為 40 ℃；流速為 1.0 mL/min[1，6]。

2.2 溶液制備

2.2.1 黃芪甲苷

對照品溶液：稱取黃芪甲苷對照品7.64 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，制備成質量濃度為0.764 g/L的溶液，即得。

黃芪配方顆粒供試品溶液：取黃芪配方顆粒0.56 g，精密稱定，置索氏提取器中，加入甲醇40 mL，冷卻過夜，加入適量甲醇，加熱回流4 h，濃縮至干，殘渣加10 mL水，微熱使溶解，以水飽和正丁醇40 mL提取4次，合并正丁醇液；氨試液40 mL洗滌2次，棄氨液，蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱（1.5 cm ×12 cm），加水 50 mL 洗脫，去水，40% 乙醇30 mL洗脫，去洗脫液，加80 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，甲醇溶解，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

黃芪最細粉供試品溶液：取黃芪最細粉4 g，精密稱定，加水10 mL，微熱使溶解，其余同配方顆粒供試品溶液項下方法制備。

黃芪飲片供試品溶液：同黃芪最細粉供試品溶液項下方法制備。

2.2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷

對照品溶液：稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品4.35 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，制備成質量濃度為0.435 g/L的對照品溶液。

黃芪配方顆粒供試品溶液：取黃芪配方顆粒0.14 g，置圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流4 h，冷卻，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液25 mL，回收溶劑，濃縮至干，甲醇溶解殘渣，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

黃芪最細粉供試品溶液：取黃芪最細粉1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，其余同黃芪配方顆粒供試品溶液項下方法制備。

黃芪飲片供試品溶液：同黃芪最細粉供試品溶液項下方法制備。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取上述對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的理論板數均大于3 000，分離良好。在此條件下的色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別吸取2種對照品溶液各2.5，5.0，10.0，15.0，20.0μL，按 2.1 項下色譜條件進樣分析。以峰面積（A）對數值為縱坐標（Y）、對照品進樣量（μg）對數值為橫坐標（X）進行線性回歸，得黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程分別為Y黃=1.522X黃+11.310（r=0.998 0，n=5），Y毛=3.57×106X毛+11 728（r=0.9990，n=5）。結果表明，黃芪甲苷與毛蕊異黃酮葡萄糖苷進樣量分別在 1.91～15.28 μg和 1.09～8.70 μg范圍內時，其對數值與峰面積對數值線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液各10 μL，在2.1項下色譜條件進樣測定，分別重復進樣6次，測定各自峰面積。結果的RSD分別為1.56%和1.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：室溫下精密量取3種供試品溶液各10 μL，室溫下分別于 0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積。結果的RSD均小于3%（n=6），表明室溫下供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：稱取3種樣品，精密稱定，同法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，共6份，分別測定黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。結果的RSD均小于2%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知黃芪甲苷含量為0.086%的同一配方顆粒6份，每份1 g，加入黃芪甲苷對照品0.5 mg，依法制備供試品溶液，進樣檢測。取已知毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.073%的同一配方顆粒6份，每份1 g，加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品0.5 mg，依法制備供試品溶液，同法測定。結果見表1和表2。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗結果（n=6）

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取黃芪不同劑型樣品各6份，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果黃芪飲片、黃芪配方顆粒、黃芪最細粉中黃芪甲苷的平均含量分別為（0.074 6±0.003 5）%，（0.056±0.004 5）%，（0.129 ±0.005 1）%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均含量分別為（0.031±0.002 1）%，（0.022±0.002 4）%，（0.025±0.001 9）%。

3 討論

中藥超微粉碎與傳統中藥打粉均為粉碎加工，但也不完全相同。中藥材傳統打粉的粒度一般為100 μm，而中藥微粉粒度可到幾微米甚至更小[6-7]。在此粒度下，植物細胞壁破碎產生的效應，以及顆粒的比表面積、表面活性、分散性等都起了綜合變化[8]。本研究結果顯示，黃芪最細粉中黃芪甲苷的含量遠高于黃芪飲片中的含量，可能是因為黃芪打成最細粉后，其細胞壁被破壞，有效成分更易溶出。

中藥配方顆粒仍有值得深究的地方。從臨床用藥情況看，中藥配方顆粒的藥效與中藥飲片的藥效并無顯著差異，但配方顆粒是單味中藥的提取[9-10]，省去了藥物間共同加熱、缺少了藥物間相互作用的過程，然而每味中藥所含成分有幾十種甚至幾千種，這些成分可能是藥方中的有效成分，但換到其他藥方中，就無法起到應有的作用[11-13]。

本研究旨在比較不同劑型黃芪的質量差異，結果顯示，3種劑型黃芪中黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均符合2015年版《中國藥典（一部）》規定，即黃芪飲片中含黃芪甲苷不得少于0.040%，毛蕊異黃酮葡萄糖苷不得少于0.020%。其中最細粉中黃芪甲苷含量最高，而3種劑型黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量差異不大，可能是因為毛蕊異黃酮葡萄糖苷暴露在空氣中易氧化，所以飲片中含量最高，配方顆粒和最細粉與空氣接觸面積增大，氧化率高，故較飲片含量略低，但無明顯差異，且含量均超藥典標準，不影響臨床使用。另外，《中國藥典》并未收載黃芪打粉使用的炮制方法，通過本試驗可知，中藥黃芪適合打粉使用[14]，同時本研究也為《四川省中藥飲片炮制規范》（2015版）[15]新增黃芪炮制方法即粉碎成細粉使用提供了理論依據。