反相高效液相色譜法測(cè)定富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥7種有關(guān)物質(zhì)含量

朱躍芳 ，姚亮元 ，林 芳 ，陳珉珉 ，朱 婧

（1.湖南省株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 株洲 412008； 2.湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000）

富馬酸替諾福韋二吡呋酯是一種核苷酸類抗病毒藥[1]，具有抗人類免疫缺陷病毒（HIV）和抗乙型肝炎（簡稱“乙肝”）病毒（HBV）活性[2-3]。2001 年經(jīng)美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療HIV-1感染；2008年4月和8月，歐盟和美國FDA又分別批準(zhǔn)其用于治療乙肝[4-6]。由于其療效確切，適用性好，也是多個(gè)治療指南推薦使用的一線抗HIV和抗HBV藥物[7-8]。目前，我國關(guān)于富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道尚少，有的檢測(cè)已知結(jié)構(gòu)雜質(zhì)數(shù)量也偏少[9-11]。本研究中采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定其原料藥有關(guān)物質(zhì)含量，為其質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；AB135-S型電子分析天平、FE-20型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥（上海陽帆醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為 120919，120920，120925，湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20130701，20130702，20130703，20170201）；替諾福韋（雜質(zhì) B）對(duì)照品（批號(hào)為100614JZ）、腺嘌呤（雜質(zhì)C）對(duì)照品（批號(hào)為20120408）、替諾福韋單吡呋酯（雜質(zhì)D）對(duì)照品（批號(hào)為121022），替諾福韋單吡呋單異丙酯（雜質(zhì)E）對(duì)照品（批號(hào)為121128-1）、替諾福韋單吡呋單乙氧基羰氧基甲脂（雜質(zhì)F）對(duì)照品（批號(hào)為130322），均購自上海陽帆醫(yī)藥科技有限公司；6-異丙氧甲酰胺替諾福韋二吡呋酯（雜質(zhì) G）對(duì)照品（批號(hào)為03-MAR-16-16）、替諾福韋二吡呋酯二聚體（雜質(zhì)H）對(duì)照品（批號(hào)為12-JUN-16-15）均為美國QCC標(biāo)準(zhǔn)品；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Polar-phenyl C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以 0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào) pH 至 4.6）-乙腈（97 ∶3，V/V）為流動(dòng)相 A，以0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào)pH至4.6）-乙腈（40 ∶60，V/V）為流動(dòng)相 B，梯度洗脫（0～25 min時(shí)85%A→50%A，25～40min時(shí)50%A→0 A，40～50min時(shí) 0 A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取雜質(zhì) B，C，D，E，F(xiàn)，G，H 對(duì)照品各適量，精密稱定，分別置7個(gè)100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋成每1 mL中分別含雜質(zhì)B1.5 mg、雜質(zhì)C1.5 mg、雜質(zhì)D 10 mg、雜質(zhì) E 3 mg、雜質(zhì) F 1.5 mg、雜質(zhì) G 1.5 mg、雜質(zhì)H 1.5 mg的單雜質(zhì)對(duì)照品貯備液，分別精密量取各1 mL，置同一100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的供試品溶液。以流動(dòng)相作為空白對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，空白對(duì)照溶液色譜圖中，在與各雜質(zhì)對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間處無干擾峰。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.25，0.50，1.00，1.50，2.00 mL，置 5 個(gè) 10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

定量限與檢測(cè)限考察：精密量取混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表1。

穩(wěn)定性考察：取供試品溶液（批號(hào)為20130701）適量，分別置室溫及 4 ℃ 下保存，于第 0，2，4，8，10，12，18，24 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。在室溫下放置24 h時(shí)，除雜質(zhì)D峰面積的RSD為5.3%外，其他雜質(zhì)峰面積的RSD均小2.0%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h不穩(wěn)定，在4℃下放置24 h穩(wěn)定。

表1 回歸方程與線性范圍（n=5）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為120919）適量，每份約10 mg，共9份，精密稱定，溶解，分別加入0.5，1.0，1.5 mL混合對(duì)照品貯備液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定

取7批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算樣品中有關(guān)物質(zhì)含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果（%，n=3）

3 討論

取雜質(zhì) B，C，D，E，F(xiàn)，G，H 對(duì)照品各適量，在 200 ～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示，所有雜質(zhì)對(duì)照品均在260 nm波長附近有最大吸收。雜質(zhì)E與雜質(zhì)F出峰時(shí)間很近，因此首先考察雜質(zhì)E與雜質(zhì)F間的分離情況，要求兩者間分離度應(yīng)大于1.5。本試驗(yàn)中對(duì)兩組色譜條件進(jìn)行了考察，第1組為甲醇-叔丁醇-0.01mol/L 磷酸氫二鈉（用磷酸調(diào) pH 至 5.5）（11∶1∶28，V/V/V）（A）-甲醇 -叔丁醇 -0.01 mol/L磷酸氫二鈉（用磷酸調(diào) pH 至 5.5）（27 ∶1 ∶12，V/V/V）（B），梯度洗脫；第2組為0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào)pH 至 4.6）-乙腈（97∶3，V/V）（A）-0.05 mol/L醋酸銨緩沖液（用冰醋酸調(diào) pH至 4.6）-乙腈（40∶60，V/V）（B），梯度洗脫。結(jié)果在第2組色譜條件下，各雜質(zhì)與主峰間分離度均大于1.5，更適合本樣品分析有關(guān)物質(zhì)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液在室溫下放置24 h時(shí)雜質(zhì)D含量明顯增加，說明供試品溶液在室溫下放置24 h不穩(wěn)定；供試品溶液在4℃條件下放置24 h總雜質(zhì)的絕對(duì)偏差小于0.1%，說明供試品溶液在4℃下放置24 h穩(wěn)定。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性好，可用于富馬酸替諾福韋二吡呋酯原料藥中7種有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定。