煙草中甲霜靈殘留快速檢測試紙條研制

袁光宇 龔維瑤 羅維超 徐明慧 賈玲玲 謝體波 鐘新敏 程茹

摘要：為開發快速檢測煙草（Nicotiana tabacum L.）中的甲霜靈殘留方法，以自制抗原、抗體為材料，研制一種膠體金免疫層析檢測試紙條，并以甲霜靈原料合成半抗原，進一步制備抗原免疫后制備甲霜靈單克隆抗體。結果表明，紙條檢測限對干煙草為1.5 mg/kg，鮮煙葉為1.0 mg/kg，與其他藥物無交叉反應，且與色譜法比較符合率為98%，假陽性率為2.3%。甲霜靈殘留試紙條檢測煙草時樣品處理簡單、檢測時間短、無需專業人員、經濟適用等特點，能夠實現煙草快速、準確、批量檢測，可為煙草中甲霜靈殘留檢測提供技術支持。

關鍵詞：煙草（Nicotiana? tabacum L.）;甲霜靈;試紙條;快速檢測

中圖分類號：TS207.5? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）02-0107-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.024? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

中國煙草（Nicotiana tabacum L.）種植歷史悠久，煙草需求量隨著經濟的發展也越來越大。煙草在種植過程中常出現黑脛病、青枯病、根腐病等[1-3]，施藥后農藥殘留情況不可避免。因此，煙草農藥殘留安全問題成為人們關注的焦點之一。

甲霜靈屬N-苯基酰胺類高效內吸性殺菌劑化合物，對由真菌引起的黑脛病具有特異殺菌效果[4]。中國在農藥殘留標準中規定了農藥甲霜靈在黃瓜、葡萄等瓜果蔬菜的最大殘留限量分別為0.5、1.0 mg/kg[5]。而在煙草行業，由中國煙草總公司制定的企業標準中，規定了甲霜靈的最大殘留限量為2.0 mg/kg[6]。

國內目前測定甲霜靈殘留的方法多采用色譜法[7，8]，該方法不僅需要購買昂貴的色譜儀，而且需要專業人員來檢測，不適合于現場快速檢測及推廣應用。貴州勤邦食品安全科學技術有限公司結合市場需求及農藥殘留檢測現狀，采用膠體金免疫技術研制出甲霜靈殘留檢測試紙條，具有高效、快速、低成本等特點，旨在為實現煙草中甲霜靈殘留的快速檢測提供一種檢測手段。

1? 材料與方法

1.1? 材料

Balb/c小鼠（北京勤邦生物技術有限公司），甲霜靈、苯霜靈、惡霉靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲啉標準品（Dr.Ehrenstorfer公司，純度≥99.0%），煙草（購自貴州省畢節、遵義、黔西南等地），弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清白蛋白、氯金酸、氯甲酸異丁酯（Sigma公司），檸檬酸三鈉、檸檬酸鈉、碳酸鉀、甲醇等（國藥集團），背板、硝酸纖維素膜、無紡布、金標墊、吸水紙（上海金標生物科技有限公司）。

HGS201型切條機、BioDot-XYZ3060型三維噴點平臺、GL-21M高速冷凍離心機（長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司），90-2型磁力攪拌器（上海振榮科學儀器有限公司）、DHP-600S電熱恒溫培養箱。

1.2? 方法

1.2.1? 抗原合成? 將甲霜靈原料溶于75%甲醇溶液，加入氫氧化鋰30 ℃反應過夜，減壓蒸餾冷卻凝固得白色固體即為甲霜靈半抗原[9]，合成路徑。稱取適量甲霜靈半抗原溶于DMF，加100 μL氯甲酸異丁酯攪拌反應30 min后加入牛血清白蛋白緩沖液，4 ℃反應過夜即得甲霜靈抗原[10，11]。

1.2.2? 單克隆抗體制備? 將合成的甲霜靈抗原與弗氏佐劑混合按50 μg/只注入Balb/c小鼠皮下，使其產生多克隆抗體。免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株[10-12]。Balb/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油7 d后，注射雜交瘤細胞株采集腹水，腹水經辛酸-飽和硫酸銨法純化，抗體濃度標定至10 μg/mL。

1.2.3? 膠體金的制備? 去離子水將氯金酸稀釋至0.02%，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100 mL氯金酸加入2 mL 1%的檸檬酸三鈉，繼續煮沸，液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水[13-15]。

1.2.4? 試紙條最佳條件篩選? 0.1 mol/L碳酸鉀調節膠體金溶液的pH至6.8，設定甲霜靈抗體終濃度梯度為5、10、15、20、25、30 ng/mL，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液[16]，篩選最佳抗體濃度。

0.1 mol/L碳酸鉀調節膠體金溶液的pH至梯度5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，依次加入最佳抗體量，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液，篩選最佳pH。

1.2.5? 試紙條的制備? 0.1 mol/L碳酸鉀調節膠體金溶液的pH至最佳值，甲霜靈抗體終濃度最佳，混勻靜置30 min后加入BSA至終濃度為2%，混勻靜置30 min后4 ℃下12 000 r/min離心30 min，棄去上清液，緩沖液將沉淀重懸，重懸沉淀即為抗體-膠體金標記物。抗體-膠體金標記物經BioDot-XYZ3060三維噴點平臺噴點到PB處理的金標墊上，恒溫烘箱烘干。

0.02 mol/L PB分別將合成的甲霜靈抗原和羊抗鼠抗體稀釋，噴點到硝酸纖維素膜上，構成T區和C區。將PB處理的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在背板上，切成4 mm寬試紙條。

1.2.6? 檢測方法及結果判讀? 取1 g煙葉剪成碎片，用5 mL甲醇浸滿樣品，振蕩1 min，靜置后移取0.15 mL混入1 mL PB稀釋液。從包裝袋取出試紙條，取3～4滴稀釋液滴加于樣孔中，反應5～10 min，判讀結果。當質控區（C區）顯示出紅色條帶，檢測區（T區）不顯色，判為陽性;當C區顯示出紅色條帶，T區顯示出紅色條帶，判為陰性;當C區不顯示出紅色條帶，該試紙條判為無效。

1.2.7? 試紙條試驗? 陰性干、鮮煙葉添加甲霜靈標準品至濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg進行樣品檢測，確定試紙條靈敏度。陰性干、鮮煙葉添加苯霜靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲啉至濃度5、10、20、50 mg/kg進行樣品檢測，判斷試紙條特異性。

將采集自貴州各地的干煙葉27份、鮮煙葉23份分別進行試紙條檢測和色譜檢測[17]。試紙條檢測結果判讀陰性標記為“-”，陽性標記為“+”。色譜檢測方法未檢出的標記為“-”，其他以實際結果標識。

2? 結果與分析

2.1? 最佳抗體濃度

甲霜靈單克隆抗體篩選最佳抗體濃度結果。在5、10、15、20、25、30 ng/mL 6個梯度中，加入氯化鈉后甲霜靈抗體終濃度為5和10 ng/mL時灰黑色較明顯并遞減，終濃度20 ng/mL后與15 ng/mL相比較，膠體金溶液顏色透亮，膠體金性質穩定。綜合考慮抗體用量及與膠體金結合情況，選擇終濃度20 ng/mL為甲霜靈單克隆抗體標記濃度。

2.2? 最佳pH

以0.1 mol/L碳酸鉀分別調節膠體金溶液的pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，依次加入甲霜靈單克隆抗體至終濃度20 ng/mL，混勻靜置30 min后加入10%氯化鈉溶液，試驗結果。結果顯示pH在6.5、7.0時所得膠體金溶液性質穩定，無灰黑色沉淀。因此，反應最佳pH范圍為6.5～7.0。

2.3? 試紙條靈敏度

試紙條分別檢測添加甲霜靈標準品濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg的干、鮮煙葉。干煙葉樣品中甲霜靈濃度為0.5、1.0 mg/kg時，試紙條結果呈陰性（-）;干煙葉樣品中甲霜靈濃度分別為1.5、2.0、2.5 mg/kg時，試紙條結果呈陽性（+），檢測結果見表1。縮小甲霜靈標準品濃度添加為1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/kg的干煙葉檢測結果見表2，當檢測濃度為1.1、1.2、1.3、1.4 mg/kg的干煙葉樣品時，試紙條結果仍呈陰性;當檢測濃度為1.5 mg/kg的干煙葉樣品時，試紙條結果呈陽性。因此，該試紙條對干煙葉甲霜靈檢測限為1.5 mg/kg。

鮮煙葉靈敏度檢測結果如表3、表4所示，分析結果可知，該試紙條對鮮煙葉甲霜靈檢測限為1.0 mg/kg。

2.4? 試紙條特異性

分別檢測向陰性干、鮮煙葉添加苯霜靈、惡霉靈、多菌靈、三唑酮、吡蟲啉至濃度為5、10、20、50 mg/kg，檢測結果見表5，陰性標記為“-”，陽性標記為“+”。其中，苯霜靈是甲霜靈結構類似物，惡霉靈常與甲霜靈混合使用，其他3種為煙草常用藥物。試紙條檢測結果顯示5種藥物均為陰性，即與其他藥物無交叉反應，試紙條特異性強。

2.5? 煙草檢測

采集自貴州畢節、遵義等各地干煙葉27份、鮮煙葉23份，共計50份，干煙葉依次編號1-27，鮮煙葉依次編號28-50。分別以試紙條方法和色譜方法檢測，甲霜靈試紙條干煙葉檢測限為1.5 mg/kg，鮮煙葉為1.0 mg/kg。試紙條檢測結果判讀陰性標記為“-”，陽性標記為“+”。色譜檢測方法，未檢出的標記為“-”，其他以實際結果標識，結果如表6所示。由表6可知，試紙條檢測與氣相色譜儀檢測煙葉中甲霜靈殘留符合率高達98%，假陽性率2.3%。說明甲霜靈殘留快速檢測試紙條能對煙草中甲霜靈定性檢測，但不能完全排除假陽性結果，對于陽性結果可以進行復檢及氣相色譜等方法進行確定。

3? 結論

甲霜靈殘留快速檢測試紙條基于免疫膠體金技術，以膠體金作為抗原抗體免疫反應的示蹤標志物[15]。半抗原的合成由甲霜靈原料一步反應完成，合成工藝簡單，對物質本身的改造較少，半抗原制備抗原后經免疫能夠獲得特異性較強的抗體。膠體金顆粒采用檸檬酸三鈉還原氯酸金，再與甲霜靈單克隆抗體復合得到Ab-膠體金標記物。標記試驗中優化了甲霜靈單克隆抗體標記量及膠體金溶液pH環境，得到最佳的甲霜靈單克隆抗體標記量為20 ng/mL，最佳金溶液pH為6.5～7.0，并建立了甲霜靈單克隆抗體-膠體金標記物制備方案。

本研究中試紙條與甲霜靈類似物苯霜靈、惡霉靈及煙草常用藥物（多菌靈、三唑酮、吡蟲啉）之間無交叉反應，試紙條檢出限為干煙葉1.5 mg/kg，鮮煙葉1.0 mg/kg。樣品檢測結果與色譜法檢測結果相比符合率高達98%，說明試紙條檢測結果穩定、可靠。使用本試紙條檢測煙草樣品與色譜法相比處理簡單、檢測時間短、無需專業人員、經濟適用等特點，能夠為煙草現場檢測、抽查、管控提供便捷。

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