11S通過NF-κB信號通路引起豬小腸上皮細胞損傷

彭成璐，張 瑜，丁雪東，李 玉，馮士彬，王希春，李錦春，吳金節

(安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥230061)

大豆球蛋白是大豆中最大的單體成分，其主要成分11S球蛋白占大豆籽實總蛋白的19.5%～23.1%，占總球蛋白的40.0%[1]。大豆球蛋白由5個亞基組成，分別被命名為A1aB2 (G1)、A1bB1b (G2)、A2B1a (G3)、A3B4 (G4)和A5A4B3 (G5)，每個亞基由堿性多肽(約20 ku)和通過二硫鍵連接的酸性多肽(約40 ku)組成[2-3]。大豆蛋白質中的大多數抗原表位存在于大豆球蛋白的酸性亞基中[4-5]。含有大豆蛋白的日糧飼喂仔豬后，大部分的11S(大豆球蛋白)和7S(β-伴大豆球蛋白)被消化酶降解成不具有抗原性的肽和氨基酸，然后被機體吸收；一些未消化的11S和7S可以進入腸道抑制腸細胞增殖，損傷細胞骨架，引起小腸細胞凋亡，或者經腸道消化后，小部分抗原蛋白能完整地進入淋巴和血液中，引發腸道過敏[3，6-7]。腸道是機體與外界環境接觸最為密切的部位，不僅是消化、吸收營養物質的重要場所，也是機體的重要免疫屏障[8]。小腸上皮細胞的增殖、遷移、分化、凋亡的動態平衡是腸屏障功能正常發揮的前提和基礎[9]。然而，細菌產物、毒素和其他過敏原的病理性吸收不僅能夠激活免疫細胞，而且直接影響腸上皮細胞的功能[10]。

吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)是一種小分子巰基化合物，它具有改變氧化還原狀態、重金屬的螯合及抑制酶等作用。PDTC現被用作NF-κB的強效抑制劑，它既能抵抗自由基的毒性作用，也能抑制促炎性細胞因子的生成[11]。Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，屬于一種非特異性一氧化氮合酶(NOS)抑制劑，能同時抑制神經元型一氧化氮合酶(nNOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達[12]。

豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)來源于仔豬空腸上皮，其功能包括消化食物、吸收營養物質、分泌消化液和免疫屏障等[6]，是非轉化的非致瘤性腸上皮細胞系，具有與體內活性相當的分化特征，適用于體外模型[13]。本研究在前期研究的基礎上，通過體外培養豬小腸上皮細胞，在分子水平上研究不同濃度11S、PDTC和L-NAME對豬小腸上皮細胞存活率以及相關炎性因子、蛋白和mRNA表達量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

11S由中國農業大學食品工程學院提供，安徽農業大學動物科技學院進一步提純(11S純度為90.8%)。IPEC-J2購自武漢市農業科學院細胞庫。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Biosharp，β-actin抗體購自北京銳抗生物科技有限公司，羊抗兔和羊抗鼠二抗購自Biosharp，p-NF-κB抗體購自Santa cruz，誘導型iNOS和環氧化酶2蛋白(COX-2)抗體購自Novus，PDTC和L-NAME購自碧云天生物技術公司。白細胞介素6(IL-6)、一氧化氮(NO)、5-羥色胺(5-HT)、白細胞介素10(IL-10)、二胺氧化酶(DAO)ELISA試劑盒購自江蘇酶標生物有限公司。

1.2 方法

將對數生長期的IPEC-J2細胞，以1×105mL-1的密度接種于6孔細胞培養板。置于37 ℃、5%(體積分數)CO2飽和濕度下培養至細胞貼壁。將細胞分為6組：A(對照組)、B (1 mg·mL-111S)、C (5 mg·mL-111S)、D(10 mg·mL-111S)、E(5 mg·mL-111S+1 μmol·L-1PDTC)和F(5 mg·mL-111S+1 μmol·L-1L-NAME)，各組中分別添加0、1、5、10、5、5 mg·mL-1的11S，并且在E組和F組分別添加1 μmol·L-1NF-κB p65(PDTC)和1 μmol·L-1iNOS(L-NAME)抑制劑。每組均設置3個重復(預實驗發現D組存活率過低，C組適中，因此選用C組作為對照組添加抑制劑)。

1.3 細胞存活率

在各組豬小腸上皮細胞中添加不同濃度的11S和抑制劑后繼續培養8、16、24 h，之后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，放入細胞培養箱中繼續培養，直至出現明顯的顏色反應。在酶標儀450 nm波長下讀取吸光度，計算細胞存活率。

1.4 5-HT、IL-6、IL-10、NO和DAO含量測定

豬小腸上皮細胞經過不同濃度11S和相應抑制劑處理培養24 h后，收集細胞，1 000g離心5 min，用PBS洗滌3次。之后向每個樣品中加入500 μL含0.1%(體積分數)Triton X-100的0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.4)，將樣品放入0 ℃水中進行超聲裂解。將細胞裂解液以1 000g離心10 min，收取上清液。按照ELISA試劑盒說明書中詳細操作步驟進行測定，計算5-HT、IL-6、IL-10、NO和DAO的含量。

1.5 Western blot法檢測p-NF-κB p65、iNOS、COX-2蛋白表達量

收集豬小腸上皮細胞，加入混有蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，漩渦振蕩器混合均勻，置于冰上20 min使細胞充分裂解。之后14 000g離心10 min，收集上清液。按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作，并根據標準曲線算出蛋白濃度。將提取的蛋白質樣品煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠中電泳，然后轉移到PVDF膜。用牛血清白蛋白(BSA)在室溫下封閉膜4 h，后放入一抗在4 ℃孵育過夜。將膜洗滌3次，并用二抗在室溫下水平震蕩孵育45 min，洗膜后放入凝膠成像系統(Bio-Rad)中成像。

1.6 qPCR法檢測NF-κB p65、iNOS、IKKβ、IKKα和COX-2 mRNA相對表達量

目的基因及β-actin內參引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的轉錄水平，引物序列及參數見表1。

1.7 數據處理

2 結果與分析

2.1 11S對豬小腸上皮細胞存活率的影響

由圖1可知：各組豬小腸上皮細胞活性差異在處理24 h時最顯著，細胞的存活率隨著11S濃度的增加而降低。與A組相比，B組細胞存活率無顯著差異(P>0.05)，C、D組細胞存活率極顯著降低(P<0.01)。與C組相比，E、F組細胞存活率顯著增加(P<0.05)。

2.2 11S對豬小腸上皮細胞生長狀態的影響

由圖2可知：A組細胞多為不規則多邊形，輪廓清晰，貼壁狀態良好。隨著11S濃度增加，B、C、D組貼壁細胞數量減少，部分細胞脫落，形態異常。與C組相比，E、F組貼壁不完全的細胞較少，脫落細胞較少。

2.3 11S對豬小腸上皮細胞NO、5-HT、IL-6、IL-10和DAO含量的影響

由圖3可知：處理24 h后，與A組相比，B組NO含量顯著升高(P<0.05)，IL-10含量顯著降低(P<0.05)，C、D組NO、5-HT、IL-6、DAO含量極顯著升高(P<0.01)，IL-10含量極顯著降低(P<0.01)。與C組相比，E、F組NO、5-HT、IL-6、DAO含量極顯著降低(P<0.01)，IL-10含量極顯著升高(P<0.01)。

表1基因引物參數

Table1Primer parameters of genes

基因Gene登錄號Accession No.引物Primer序列(5′→3′)Sequences (5′→3′)產物Product/bpNF-κB p65ID: 100514505ForwardCTCGCTCGCACTCTTGCTCTC168ReverseAATAGGCGGACGAGGCAGAAGiNOSNM_001143690.1ForwardGGGTCAGAGCTACCATCCTC114ReverseCGTCCATGCAGAGAACCTTGIKKβNM_001099935.1ForwardACCTGGCTCCCAACGACTT184ReverseAGATCCCGATGGATGATTCTGIKKαNM_001114279.1ForwardCACTCTTACAGCGACAGCAC145ReverseCCACCTTGGGCAGTAGATCACOX-2NC_000845.1ForwardTGCACGGCGGCAATATTAAA156ReverseAGTGGAAGTGTGCGACTACAactin414396ForwardCTGGACTTCGAGCAGGAGATGG168bpReverseTTCGTGGATGCCGCAGGATTC

A，對照； B，1 mg·mL-1 11S；C，5 mg·mL-1 11S；D，10 mg·mL-1 11S；E，5 mg·mL-1 11S+1 μmol·L-1 PDTC；F，5 mg·mL-1 11S+·1 μmol·L-1 L-NAME。下同。A， control group; B， 1 mg·mL-1 11S; C， 5 mg·mL-1 11S; D， 10 mg·mL-1 11S; E， 5 mg·mL-1 11S+1 μmol·L-1 PDTC; F， 5 mg·mL-1 11S+1 μmol·L-1 L-NAME. The same as below.圖1 豬小腸上皮細胞存活率Fig.1 Viability of porcine intestinal epithelial cell

黑色方框表示具有代表性的區域。Black square frame represented typical area.圖2 11S對細胞生長狀態的影響(400×)Fig.2 Effect of 11S on growth state of porcine intestinal epithelial cell (400×)

*和**表示與對照組相比，差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；##表示與C組相比，差異極顯著(P<0.01)。下同。* and ** indicated significant differences at P<0.05 and P<0.01 compared with control group;## indicated significant differences at P<0.01 compared with group C. The same as below.圖3 11S對豬小腸上皮細胞NO、5-HT、IL-6、IL-10和DAO含量的影響Fig.3 Effect of 11S on NO， 5-HT， IL-6， IL-10 and DAO contents in porcine intestinal epithelial cell

2.4 11S對豬小腸上皮細胞p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表達量的影響

如圖4所示，處理24 h后，與A組相比，C、D組p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表達量顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與C組相比，E、F組顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

2.5 11S對豬小腸上皮細胞NF-κB p65、iNOS、IKKβ、IKKα和COX-2 mRNA相對表達量的影響

如圖5所示，處理24 h后，與A組相比，B組NF-κBp65、iNOS、COX-2 mRNA相對表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高，C、D組NF-κBp65、iNOS、COX-2 mRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)。與C組相比，E、F組NF-κBp65、iNOS、COX-2 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。

3 結論與討論

本研究結果表明，11S通過NF-κB信號通路引起豬小腸上皮細胞損傷，促進細胞分泌NO、5-HT和IL-6，抑制IL-10的分泌，增加p-NF-κB p65、iNOS和COX-2的蛋白表達量及NF-κBp65、IKKβ、iNOS、IKKα和COX-2 mRNA的相對表達量，添加PDTC和L-NAME后抑制了11S對細胞的損傷作用。

Sun等[14]研究發現，11S可通過誘導超敏反應、結合于動物腸道組織來影響動物腸道健康，其誘導的超敏反應主要是一個Th2型的免疫應答，由IgE抗體介導，可導致仔豬腹瀉和生產性能降低，過敏性反應的嚴重程度取決于11S的劑量。徐君[2]用不同濃度的大豆抗原蛋白處理小鼠腸上皮細胞，小鼠腸上皮細胞總數量減少，不規則形狀和輪廓不清晰的細胞明顯增多，細胞脫落程度加大。本試驗在各組豬小腸上皮細胞中添加不同濃度的11S后，豬小腸上皮細胞的存活率及貼壁細胞數量隨著11S濃度的增加和培養時間的延長而降低，添加5 mg·mL-111S+1 μmol·L-1PDTC或5 mg·mL-111S+1 μmol·L-1L-NAME的處理細胞存活率及貼壁細胞數量高于僅添加5 mg·mL-111S的處理。韓蕊[6]用不同濃度的11S處理豬小腸上皮細胞24 h，隨著11S濃度的升高，豬小腸上皮細胞的存活率顯著降低，本實驗結果與此相一致。說明11S引起豬小腸上皮細胞損傷，PDTC或L-NAME可以抑制11S引起的損傷。

圖4 11S對豬小腸上皮細胞p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表達量的影響Fig.4 Effect of 11S on expression of p-NF-κB p65， iNOS and COX-2 proteins in porcine intestinal epithelial cell

圖5 11S對豬小腸上皮細胞NF-κB p65、iNOS、IKKβ、IKKα和COX-2 mRNA的影響Fig.5 Effect of 11S on relative expression of NF-κB p65， iNOS， IKKβ， IKKα and COX-2 mRNA in porcine intestinal epithelial cell

DAO主要分布于哺乳動物腸道(占95%)，活性高，以空腸和回腸活性最高，是哺乳動物腸絨毛上皮細胞的標記酶，其活性與絨毛高度、黏膜細胞的核酸和蛋白質密切相關，可作為判斷腸黏膜屏障功能損傷的敏感指標[15-17]。本試驗中，隨著11S濃度增加，DAO含量極顯著升高，添加抑制劑后DAO含量極顯著降低。曹程鳴等[18]通過體內試驗發現，大豆抗原蛋白可以降低仔豬腸道絨毛長度，增加斷奶仔豬血漿DAO水平，本試驗結果與此一致。

張建中等[19]研究發現，大豆抗原蛋白對斷奶仔豬腸道造成損傷的原因可能與其提高腸道黏膜NF-κB活性，引起細胞因子過度表達，導致腸道炎癥反應有關。本試驗發現，11S可誘導豬小腸上皮細胞p-NF-κB p65、iNOS和COX-2蛋白表達和NF-κBp65、iNOS、COX-2、IKKα和IKKβmRNA的相對表達量，在5 mg·mL-111S的基礎上，添加PDTC和L-NAME后11S的作用受到抑制。說明PDTC和L-NAME可以通過抑制NF-κB信號通路進而抑制11S對豬腸上皮細胞的損傷。王新等[20]研究發現，給大鼠胃內注射L-NAME抑制劑，能使肝硬化大鼠胃腸道中各型NOS的表達減少，這說明L-NAME抑制劑能干預調節NOS的表達，本研究結果與此一致。周艷梅[11]研究發現，PDTC既能抵抗自由基的毒性作用，又能抑制促炎性細胞因子的生成。本試驗ELISA檢測發現，隨著11S濃度增加，NO、5-HT、IL-6含量極顯著升高，添加抑制劑后顯著降低。劉欣[21]通過灌胃小鼠11S和7S，發現小鼠小腸組織中IL-10 mRNA的表達量降低，本試驗結果與此一致。NO誘導細胞凋亡的機制主要在于激活凋亡的死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑[19]，NO還能夠影響炎癥反應的進程，進而影響IL-6、組胺、5-HT、TNF-α等炎癥因子的表達[22]，本試驗結果與此一致。表明11S激活通過NF-κB信號通路，促進炎性因子分泌，造成豬腸上皮細胞損傷，PDTC和L-NAME可以抑制這種損傷。11S引起的細胞損傷由多個信號通路介導，各個通路之間的相互作用及影響還有待研究。