BTLA、LAG3 和TIM3 在上皮性卵巢癌組織中的表達意義

朱元媛 閆洪超 劉永利 李欣

1徐州醫科大學研究生學院（江蘇徐州221002）；2徐州醫科大學附屬醫院婦產科（江蘇徐州221006）；3徐州醫科大學附屬徐州市第一人民醫院婦產科（江蘇徐州221002）；4徐州醫科大學附屬徐州市婦幼保健院婦科（江蘇徐州221009）

上皮性卵巢癌是女性生殖系統腫瘤中病理類型最多且最復雜的惡性腫瘤之一，疾病發病率逐年升高，發病年齡年輕化，早期即可出現盆腔腹膜轉移及淋巴結轉移，在女性生殖系統惡性腫瘤中，病死率最高［1］，上皮性卵巢癌的診斷及治療已成為研究熱門。新近研究發現，T 細胞包含抗病毒及抗腫瘤功能，多種免疫抑制受體參與T 細胞免疫調控［2］，如淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene?3，LAG3）、PD?1、CTLA?4、B 和T 淋巴細胞弱化因子（B and T lymphocyte?attenuator，BTLA）和T 細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin mucin 3，TIM3）［3］，抑制免疫檢測點功能，可提高T 細胞抗腫瘤作用，因而免疫抑制劑占有愈來愈重要的地位。QUAN等［4］、SEKAR 等［5］、LAN 等［6］在血液腫瘤、乳腺癌小鼠模型及胃癌中證實BTLA 高表達。PARRA等［7］研究LAG3 在肺癌中高情況。TIM3 證實高表達于前列腺癌細胞［8］、肝癌細胞［9］。迄今為止，在人類實體腫瘤來源的細胞中分析了BTLA、LAG3、TIM3 等共抑制分子［10］，在上皮性卵巢癌的表達情況的研究罕見。本文首次探討和研究卵巢癌中BTLA、LAG3、TIM3 的表達情況，證實其高表達及作為免疫檢測點的意義，為免疫抑制劑的制作提供參考。本文應用免疫組化PV法檢測了擁有有效隨訪資料的卵巢上皮性癌患者的卵巢組織，研究LAG3、BTLA 和TIM3 在卵巢癌組織中的表達，以探討其在卵巢癌中的表達及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集徐州醫科大學附屬醫院、徐州醫科大學附屬徐州市婦幼保健院及徐州醫科大學附屬徐州市第一人民醫院在2010年1月至2013年1月期間通過手術治療的有隨訪資料的上皮性卵巢癌患者在病理科的組織蠟塊，共84 例，4 例失訪，80 例包括卵巢漿液性腺癌56 例，黏液性腺癌20 例，子宮內膜樣腺癌4 例。同時收集38 例良性上皮性卵巢腫瘤組織蠟塊，包括27 例漿液性囊腺瘤，11 例黏液性囊腺瘤。12 例交界性上皮性卵巢腫瘤組織蠟塊。并隨機選取同期因子宮肌瘤切除的正常卵巢組織30 例。納入標準：患者擁有完整的臨床信息及病理資料；術后及時隨訪。排除標準：除外合并其他系統惡性腫瘤；除外轉移自生殖系統其他器官的惡性腫瘤；除外首次治療方案為化療、放療或內分泌治療。患者手術日期為隨訪起點，死亡日為隨訪終點，2018年1月為隨訪截止日期。標本均取自病理科且經病理確診，10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm 切片。上皮性卵巢癌患者以FIGO 分期，WHO 組織學分級。隨訪總時間為3.1～63.2 個月，中位生存時間為30.4個月。本研究均經倫理委員會批準，且獲得患者及家屬知情同意。

1.2 實驗試劑 BTLA 兔抗人多克隆抗體、TIM3鼠抗人多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；LAG3 鼠抗人多克隆抗體購自美國abcam 公司；超敏兔及鼠兩分法試劑盒（PV?9001）、DAB 試劑盒購自北京中衫金橋公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化PV 法，將所有標本石蠟切片至于二甲苯及梯度乙醇脫臘水化，PBS浸泡，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，冷卻至室溫，去除內源性過氧化物酶活性。特異性一抗（濃度為1∶50 的BTLA 兔抗人；濃度為1∶50 的LAG3 兔抗人；濃度為1∶50 的TIM3 鼠抗人；）滴于標本玻片4 ℃過夜，恢復室溫后再滴加特異性生物素化二抗，辣根溶液覆蓋玻片樣本，滴加DAB 顯色劑，蘇木素染色，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹膠封片，于400 倍顯微鏡下觀察結果。

1.4 結果判定 以染色強度結合陽性細胞數占總細胞數的百分比進行半定量分析。BTLA、LAG3和TIM3 均表達于細胞膜，呈棕黃色顆粒。染色強度分四度：不著色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。鏡下陽性細胞數百分比分四度：＜1%計0 分，陽性細胞百分比1%～30%計1 分，30%～70%計2 分，70%～100%計3 分。每張切片分析時將兩項分數相加，1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為中陽性（++），5～6 分為強陽性（+++），0 分為陰性（-）。

1.5 統計學方法 所有統計數據分析時，應用SPSS 25.0 統計學軟件，免疫組化陽性表達情況行卡方檢驗，BTLA、LAG3、TIM3 分別與臨床病理因素同樣采用卡方檢驗分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。采用Kaplan?Meier 壽命表法行單因素生存分析繪制生存曲線、COX 比例風險模型進行多因素生存分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BTLA、LAG3 和TIM3 在卵巢組織中的表達 正常卵巢組織、良性、交界性上皮卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌中BTLA 的陽性率分別為0%、31.6%、50%、91.25%；LAG3 的陽性率分別為16.7%、34.2%、83.3%、87.5%；TIM3 的陽性率分別為10%、47.4%、83.3%、95%。差異有統計學意義，呈上升趨勢（P＜0.001）。見圖1～3。

圖2 LAG3 在不同組織中表達（IHC×400） Fig.2 Expression of LAG3 in different tissues

圖3 TIM3 在不同組織中表達 Fig.3 Expression of TIM3 in

2.2 BTLA、LAG3 和TIM3 與卵巢癌臨床病理因素的差異分析 早期（Ⅰ/Ⅱ期）上皮性卵巢癌BTLA、LAG3 和TIM3 的表達陽性率低于晚期（Ⅲ/Ⅳ期），差異具有統計學意義（P=0.004、0.01 及0.023），表明期別越晚，陽性表達率越高。有淋巴結轉移者，BTLA、LAG3 和TIM3 的陽性表達率越高（P=0.016、0.036 及0.002）。LAG3 表達與組織學分級呈負相關，分級越高，分化程度越低，陽性表達率越高（P=0.017），而BTLA 及TIM3 與組織學分級無明顯相關性（P=0.786 及0.126）。BTLA、LAG3、TIM3 與年齡（P=0.759、0.383 及0.596）、組織學類型（P=0.809、0.052 及0.165）及腹腔轉移（P=0.553、0.091 及0.124）無關，差異無統計學意義（P＞0.5）。

2.3 BTLA、LAG3和TIM3的表達與卵巢癌患者的生存分析 應用Kaplan?Meier 法壽命表法，BTLA陰性表達的患者生存曲線明顯高于陽性表達組，BTLA 表達（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時間為51.1、29.4、30.0、28.2 個月，整體比較差異有統計學意義（P=0.004），兩兩比較發現陰性與陽性表達差異有統計學意義（P=0.015、0.002、0.001），不同程度陽性表達間差異無明顯統計學意義（P=0.084、0.758、0.793），預后差。LAG3 表達（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時間為49.1、31.0、29.8、25.6 個月，整體比較差異有統計學意義，兩兩比較發現陰性與陽性表達差異有統計學意義（P=0.016、0.002、0.000），不同程度陽性表達間差異無明顯統計學意義（P=0.521、0.116、0.189），預后差。TIM3 表達（-）、（+）、（++）、（+++）的平均生存時間為56.4、34.2、31.7、28.4 個月，整體比較差異有統計學意義（P=0.001），兩兩比較發現陰性與陽性表達差異有統計學意義（P=0.023、0.008、0.001），不同程度陽性表達間差異無統計學意義（P=0.367、0.130、0.377），預后差。見圖4。

圖4 BTLA，LAG3 及TIM3 表達與卵巢癌患者的生存分析Fig.4 Survival Analysis Of Patients Whose BTLA，LAG3 And TIM3 Positive Expression

2.4 BTLA、LAG3 和TIM3 的表達與卵巢癌患者的Cox單因素及多因素生存回歸分析 單因素生存分析提示，生存時間與FIGO分期（P＜0.01）、淋巴結轉移（P＜0.01）、LAG3（P＜0.01）、TIM3（P＜0.01）、BTLA（P=0.004）蛋白的陽性表達有關（P＜0.05）。而與年齡（P=0.75）、組織學分級（P=0.951）、組織學類型（P=0.77）、有無腹水（P=0.13）無關。將BTLA、LAG3、TIM3 分別納入FIGO 分期、淋巴結轉移的Cox 多因素生存分析回歸模型，提示淋巴結轉移、BTLA、LAG3、TIM3為累積生存率的獨立危險因素（P＜0.01）。BTLA、LAG3、TIM3 陰性表達的患者相對危險度比陽性表達的患者低，且隨陽性表達率的升高，相對危險度升高，預后變差（P＜0.01）。

3 討論

上皮性卵巢癌是目前病死率最高的女性生殖系統惡性腫瘤，往往因為缺乏有效的早期診斷方法，多于晚期發現，且無有效的治療方法，大大降低患者生存率及生存時間。當前，針對上皮性卵巢癌的治療，多以手術為主，化療為輔，而免疫抑制劑的使用為許多惡性腫瘤的治療帶來了福音。

BTLA 屬于CD28 家族新成員［11］，在活化T 細胞尤其是Th1 細胞高表達［4］，與其配體皰疹病毒進入介質（HVEM）相互作用時產生免疫抑制效應，負性調控淋巴細胞，抑制T 細胞活化，起到抗腫瘤作用［12］。目前的研究是首次使用免疫組化方法在卵巢癌組織中檢測BTLA，正常組織中無明顯BTLA陽性表達，在上皮性卵巢癌組織中BTLA 表達情況高于良性上皮性卵巢腫瘤，同樣高于交界性上皮性卵巢腫瘤，證實BTLA 表達與卵巢癌相關，且隨上皮性卵巢癌FIGO 分期增加、淋巴結轉移范圍擴大，其陽性表達率越高，預后越差。從單因素和多因素分析顯示，BTLA 作為卵巢癌患者獨立預后因素具有重要指向性作用，推測BTLA 過度表達導致較差的預后，因為T 細胞活化的下調程度較大，可通過檢測BTLA 表達情況推測患者預后，阻斷BTLA 途徑可能是治療卵巢癌的新方法。

LAG?3 為免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，與配體MHC?II 類分子結合能夠抑制T 細胞的成熟、分化及增殖，造成癌細胞免疫逃逸［13］，LAG3 高表達于Th1 細胞，通過抗LAG3 抗體阻斷LAG?3 可以恢復Th1 細胞功能，增強腫瘤壞死因子IFN?γ 的分泌及其細胞毒性作用［14］。目前國內針對LAG3 在女性惡性腫瘤上皮性卵巢癌還尚未有研究報導。本研究發現，應用免疫組化法證實80 例上皮性卵巢癌組織中的LAG3 分子的表達情況，表達率高于正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤及交界性上皮性卵巢腫瘤。惡性卵巢癌中的陽性表達率為87.5（70/80），其中強陽性表達者為47.5（38/80），與PARRA 等［7］在肺癌中的研究結果一致。本次研究結果，LAG3 的表達水平與上皮性卵巢癌的分期、分級及淋巴結轉移有關。臨床病理分期越晚，病理分級越高，分化越低及淋巴結的轉移者，其陽性表達率越高，生存率越低，提示其可能作為判斷預后的指標，LAG3 高表達減弱腫瘤免疫及抑制作用，參與卵巢癌的發生，并與惡性程度相關。

TIM3 為KUCHROO 等［15］發現的新型基因家族成員，與半乳糖凝集素-9 相互作用可導致Th1細胞和Tc1 細胞凋亡［16］，抑制T 細胞生長及增殖，減弱其分泌細胞因子能力及增殖能力［17］，TIM3 失活，T 細胞抗腫瘤作用也增強［18］。本研究發現，TIM3 表達在正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌中表達遞增，差異有統計學意義，TIM3 在上皮性卵巢癌組織中高表達，且隨FIGO 分期的期別增加、淋巴結轉移范圍擴大，其陽性表達程度遞增，平均生存時間縮短，預后較差。依據單因素及多因素分析，TIM3 可作為判斷卵巢癌預后的獨立危險因素，通過檢測TIM3 可作為卵巢癌早期診斷的相對可靠指標。

本研究發現，BTLA、LAG3、TIM3 的陽性表達情況與上皮性卵巢癌的生存時間呈負性相關，且根據多因素相關分析，得出BTLA、LAG3、TIM3 為影響卵巢癌預后的獨立危險因素，據此推測，檢測BTLA、LAG3、TIM3 可作為判斷上皮性卵巢癌患者預后的特異性腫瘤因子，有益于上皮性卵巢癌的早期篩查及早期診斷。BTLA、LAG3、TIM3 作為免疫檢測靶點已證實在上皮性卵巢癌組織中高表達，其參與T 細胞的負性免疫調控，抑制BTLA、LAG3、TIM3 的活性，可以增強T 細胞抗腫瘤作用，阻斷BTLA、LAG3、TIM3 途徑可作為新的免疫抑制治療，大大提高患者生存率。本研究樣不足之處在于樣本量較小，其在卵巢癌中的意義及作用仍需加大樣本進一步研究。