FOXL2基因對乳腺癌細胞MCF-7生長的影響

曲春安 張偉 尹迪迪 李東岳 李敏 王曉雨 張欣 唐勝建

濰坊醫學院整形外科研究所（山東濰坊261000）

FOXL2是由單一外顯子編碼的一個叉頭型轉錄因子，屬于叉頭框轉錄因子超家族中的一員，與小瞼裂綜合征（blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome，BPES）、卵巢早衰有關，并參與性別決定。此外，FOXL2在多種腫瘤組織之中也有表達，已被發現的與該基因有關的腫瘤包括結直腸癌、卵巢顆粒細胞瘤、乳腺癌、性索間質細胞的腫瘤等。目前，癌癥問題已成為了全球熱點問題，尤其是相關基因，如癌基因、抑癌基因等研究越來越得到重視。基因層面的研究有望成為治療及預防癌癥的重要手段，基因的靶向治療研究已成為熱點。例如，在97%的成人卵巢顆粒細胞腫瘤中均發現了FOXL2基因的突變（402C突變為G），并且該突變基因具有較高特異性［1-2］。另外，在結直腸癌中也發現了FOXL2位點的失活，是體細胞超甲基化所導致的［3-4］。2011年WEGMAN等［5］率先發現在乳腺癌中也有FOXL2基因的表達，并證明可能與芳香化酶的表達及臨床預后相關。WANG等［6］通過研究表明，miR-30a為乳腺癌、小細胞肺癌及結腸癌的腫瘤抑制因子，而FOXL2基因正是miR-30a的靶向基因，FOXL2基因可以促進miR-30a的表達，而miR-30a又可以通過上調BCL2A1、IER3及cyclin D2來抑制FOXL2基因的表達，從而實行相互調控［6-7］，由此也說明FOXL2與乳腺癌有關［8-10］。因此，筆者分析并探討了FOXL2在乳腺癌細胞系中的表達及FOXL2對乳腺癌細胞生長狀況的研究，進而研究BPES相關基因FOXL2與乳腺癌的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺上皮細胞HBL-100和人乳腺癌上皮細胞MCF-7均購自中國科學院干細胞庫；胎牛血清FBS和1640培養液（Gibco公司）；MEM和Trizol（上海拜力生物科技有限公司）；胰蛋白酶（BBI公司）；兔抗人FOXL2抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色液試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RT-PCR試劑盒及相關實驗試劑（日本Takara公司）；DNA Marker（TIANGEN公司）；RIPA裂解液（普利萊基因技術有限公司）；BCA蛋白試劑盒（Thermo公司）；FOXL2-pEGFP質粒、FOXL2-shRNA質粒（上海吉凱基因科技有限公司）。

1.2 細胞培養HBL-100細胞置于RPMI-1640培養液之中培養，MCF-7細胞培養液中含有87%的MEM、10%FBS、1%雙抗（中國科學院細胞庫）、1%谷氨酸、1%非必須氨基酸以及人重組胰島素，均置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養，當細胞生長密度約90%時應用0.05%Trypsin-EDTA消化傳代1次。因HBL-100細胞染色體組型在第7代時就不正常，故本試驗選取傳代次數＜7次且處于指數生長期的HBL-100及MCF-7細胞進行后續試驗。

1.3 HBL?100和MCF?7細胞中FOXL2mRNA的檢測 采用熒光定量RT-PCR法。首先，分別取HBL-100和MCF-7細胞中依次加入Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇和DEPC水，提取兩組細胞的總RNA。紫外分光光度計測總RNAOD260/280=1.8～2.0時即為目的RNA。Primer5.0設計引物：GAPDH（230 bp）：sense：5′-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3′，Anti-sense：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3′；FOXL2（126 bp）：sense：5-TCACGCTGTCCGGCATCTACCA-3′，Anti-sense：5′-GCGGCACCTTGATGAAGCACTC-3′。應用 PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser按說明書進行逆轉錄反應。再應用SYBR Green Mix在Eppendorf實時熒光定量PCR儀上進行擴增及熒光檢測，按說明書操作，配置反應體系為25 μL，以GAPDH為內參，反應結束后得到相應的Ct值，進行溶解曲線及擴增曲線分析。統計計算兩組FOXL2 mRNA相對表達量差異有無統計學意義。

1.4 過表達及沉默FOXL2的MCF?7細胞中FOXL2蛋白的檢測采用Western blot方法檢測過表達及沉默FOXL2的MCF-7細胞模型是否成功建立。在細胞生長達90%時，加入胰酶消化后接種于6孔板中，每孔2 mL。置于恒溫培養箱中培養24 h后，進行Lip2000轉染實驗。

1.4.1 質粒轉染（1）分別將5 μg的FOXL2-pEGFP質粒和5 μg的FOXL2-shRNA質粒溶解于250 μL的無血清培養基中，標記為A、B兩管。（2）取C、D兩管分別加入等量的10 μL的Lip2000溶解于250 μL的無血清培養基中，室溫靜置5 min。（3）分別將A、B兩管混合標記為E，C、D兩管混合標記為F，室溫靜置20 min。（4）20 min后分別將E、F加入至含有1 mL培養液的MCF-7細胞中。（5）轉染4～6 h后觀察細胞生長密度為90%～95%時，將無血清的培養液換成含10%FBS的培養液，置于37℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中培養。

1.4.2 Westernblot檢測兩組MCF?7細胞中FOXL2蛋白的表達水平 轉染后48 h分別用Western blot方法檢測E、F兩組MCF-7細胞中FOXL2蛋白的表達水平。用攜帶FOXL2的過表達及沉默的質粒瞬時轉染，使其過表達FOXL2（A組）及沉默FOXL2（B組）以及未作處理的對照組（C組），分別取3組MCF-7細胞依次加入裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定3組蛋白濃度，取適量蛋白產物中加入Loading Buffer，置入沸水中加熱至變性，進行蛋白質SDS-PAGE電泳，將電泳后所得到的蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，按一抗與封閉液1∶400比例稀釋FOXL2一抗，4℃孵育過夜，TBST洗掉一抗3次，每次10 min，再按二抗與封閉液1∶10 000比例稀釋FOXL2二抗，室溫孵育1 h，TBST洗去二抗3次，每次15 min，最后在暗室中用ECL化學發光試劑盒進行發光、顯影和定影，膠片用清水沖洗后晾干，獲得實驗結果。采用Image-Pro Plus軟件對此實驗結果進行灰度值分析，目的蛋白的灰度值=目的蛋白的累積光密度值（integrated optic density，IOD）/內參的 IOD值。本實驗以GAPDH作為內參。

1.5 MTT法測細胞增殖情況取指數生長的MCF-7細胞按3×103個細胞/孔分別接種于96孔板，置于恒溫培養箱中培養24 h后，分別用攜帶FOXL2的過表達及沉默的質粒瞬時轉染，使其過表達FOXL2（A組）及沉默FOXL2（B組）以及未作處理的對照組（C組），每組分別于轉染后連續7 d，檢測3組細胞的增殖情況。在酶標儀上490 nm處記錄每孔的OD值。以培養時間作為橫坐標，OD值作為縱坐標，繪制細胞增殖的曲線，并計算細胞的增殖率。細胞增殖率＝實驗組A組及B組的OD值/C組的OD值。實驗重復3次。

1.6 統計學方法采用SPSS統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較選用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT?PCR法檢測兩組細胞的FOXL2mRNA的表達水平

2.1.1 cDNAPCR及電泳結果 成功提取到HBL-100和MCF-7細胞的總RNA，經紫外分光光度計測得兩組細胞的OD值，HBL-100細胞的OD值為1.96，MCF-7細胞的OD值為1.91，其值均在1.8～2.0之間，說明RNA純度良好。引物設計GAPDH片段長度為230 bp，FOXL2片段長度為126 bp。通過對比marker條帶，凝膠成像結果清楚地顯示了GAPDH和FOXL2兩條條帶，證明在兩組細胞中均檢測到了FOXL2基因的表達，且FOXL2在MCF-7細胞比HBL-100細胞中條帶更亮，說明FOXL2在MCF-7細胞中表達量更高（圖1）。逆轉錄PCR結果雖然顯示了FOXL2基因在兩種細胞中均表達，但只能大致顯示出FOXL2在兩種細胞中的表達，故筆者通過實時熒光定量PCR來檢測FOXL2基因在兩種細胞中的表達情況。

圖1 兩組細胞總mRNA 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 Results of total mRNA 1%agarose gel electrophoresis in two groups of cells

2.1.2 實時熒光定量PCR檢測FOXL2基因和內參基因內參基因及目的基因的熒光定量PCR擴增曲線良好，溶解曲線均為單峰，說明無引物二聚體出現。2-ΔΔCt法計算兩組 FOXL2 mRNA 的相對表達量，2-ΔΔCt值=2.175，證明FOXL2在MCF-7細胞中表現為上調，且差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。這表明，一方面，FOXL2基因在HBL-100和MCF-7細胞中均是表達的；另一方面，相比乳腺正常細胞，MCF-7細胞可能通過某種機制促進FOXL2基因的表達。

表1 HBL-100和MCF-7細胞定量曲線值Tab.1 Quantitative curve values of HBL-100 and MCF-7 cells

2.2 WesternBlot檢測FOXL2蛋白 成功轉染MCF-7細胞后，Western blot結果與C組相比，A組細胞中FOXL2蛋白表達量較C組增加了34.6%，B組細胞中FOXL2蛋白表達量較C組下降了40.4%，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖2），可見模型構建成功。

圖2 Western Blot法檢測FOXL2轉染MCF-7后FOXL2蛋白的相對表達量Fig.2 Detection of relative expression of FOXL2 protein in MCF-7 transfected with FOXL2 by Western Blot

2.3 MTT法檢測細胞增殖MTT法檢測3組MCF-7細胞轉染FOXL2后連續7 d的OD值，如圖3所示，計算其細胞增殖率，經統計分析，A組FOXL2基因過表達，MCF-7細胞的增殖能力明顯被抑制，而B組的細胞增殖能力增加，從第3天起差異有統計學意義，A組和B組的增殖率分別為12%和43%，且第5天起的增殖活力差異最明顯，兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 MTT法檢測3組MCF-7細胞轉染后細胞的增殖情況Fig.3 Detection of the proliferation of MCF-7 cells in three groups after transfection by MTT assay

3 討論

迄今為止，圍繞FOXL2基因所展開的研究仍然是相關領域的一大熱點，包括遺傳學、眼科、婦產科、腫瘤等，在性別分化、卵巢顆粒細胞的分化、卵巢及顱面部的發育及功能維持等方面發揮著不可替代的作用。該基因最早是由CRISPONI等［11］在BPES患者體內發現并克隆定位的。BPES是一種常染色體的顯性遺傳病，主要表現為瞼裂狹小、反向內眥贅皮、上瞼下垂及內眥遠距等癥狀，部分患者還伴有鼻梁低平、眥距增寬、發育遲緩、智力低下、小頭和耳畸形等［12-15］。在過去的30年內，濰坊醫學院整形外科研究所收集并隨訪了近67個家系共312例BPES患者的臨床資料，并發現了6個新的基因突變，其Genebank ID分別為：DQ089670、DQ089671、DQ089672、bankit1169075、FJ598615、FJ589614，并已注冊；另外在32%～40%的BPES患者體內并未檢測到FOXL2基因的突變。

乳腺癌作為全球女性病死率最高的惡性腫瘤，其發病率一直呈上升趨勢，化療仍是目前臨床上治療乳腺癌的主要方法，但患者對化療的反應不一，因此，如何有效地預測患者的化療療效及不良反應是合理使用化療藥物治療乳腺癌的關鍵。十幾年來，研究導致乳腺癌的發病機制及發生發展的關鍵因素及其通路一直是熱點。FOXL2基因通過調控下游 Inhibin、CYP19A、SOX9、Grip1、BSTAR等基因的表達，參與雌激素的合成，進而決定性別等［16］。如芳香化酶為類固醇激素合成途徑的關鍵酶，負責將雄激素轉化為雌激素［17-18］。2011年WEGMAN等［5］發現在乳腺癌中也有FOXL2基因的表達，證明可能與芳香化酶的表達及臨床預后相關。因此，對于小瞼裂相關基因FOXL2與乳腺癌之間關系的研究顯得尤為重要。

通過本次實驗，筆者利用RT-PCR技術再次驗證了FOXL2在乳腺癌細胞及乳腺正常細胞中的表達水平，并發現FOXL2在乳腺癌細胞中的表達水平更高；筆者的實驗結果提示，FOXL2可能在乳腺癌的發生和發展中發揮著一定的生物學作用，因此筆者構建了過表達及沉默FOXL2的MCF-7細胞模型進行后續的研究；通過Western Blot實驗，驗證了模型的構建，最后，MTT法檢測乳腺癌細胞的增殖水平，結果為過表達FOXL2基因的MCF-7細胞的增殖能力明顯被抑制，而沉默FOXL2基因的MCF-7細胞的增殖能力增加，證明該基因對于乳腺癌細胞有明顯的生物學作用，抑制了乳腺癌細胞的增殖，很有可能會成為一種新的抑癌基因或者是其他相關因子，可能為乳腺癌的綜合治療提供一種新的作用靶點，但具體的調控機制有待于大量的后續實驗的研究。因此，仍需要對該基因的轉錄及翻譯的調控機制進行研究，把FOXL2基因納入到人體總調控的整體網絡上，進一步研究其承上啟下的功能，進而為乳腺癌的預防及治療提供新的思路。

綜上所述，FOXL2基因在乳腺細胞及乳腺癌中均轉錄mRNA，但僅在乳腺癌細胞之中高表達。一方面，FOXL2可以抑制乳腺癌細胞的增殖，這個生物學作用可能主要是與芳香化酶的表達有關；另一方面，FOXL2可能是一個新的腫瘤抑制因子，對乳腺癌的轉移及復發有一定的價值，但仍需要做進一步的研究。