雷公藤紅素對腸癌細胞CCL-244干性的作用機制

蘇蘭娣 李芹 江秀玲 羅雪 彭建明

揚州市職業大學醫學院（江蘇揚州225009）

腸癌是惡性腫瘤中常見的死亡原因之一。根據美國腫瘤協會的統計，在2016年美國大約有140萬的腸癌患者，此外還有134 490例新發的腸癌患者［1］。因此，腸癌已經成為急需解決的全球健康問題之一。現有研究發現，腸癌主要由腫瘤干細胞所起始，腫瘤干細胞是實體瘤中一小群的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞能夠驅動惡性腫瘤的發生、發展和轉移［2-4］。腫瘤干細胞最初在急性髓細胞白血病中被發現，隨后在其他多種類型的腫瘤如乳腺癌、腸癌、肺癌等亦存在腫瘤干細胞。雖然腫瘤干細胞在腸癌細胞中的比例不高，但腫瘤干細胞卻是促使腸癌惡性進展、轉移、復發和耐藥的罪魁禍首［2，4］。因此，靶向腸癌干細胞已成為抗腸癌藥物研發中的熱點。

雷公藤紅素（Celastrol）是一種五環三萜類化合物，主要來源于雷公藤、南蛇藤等植物。研究顯示，雷公藤紅素具有抗炎、抗生育、抗菌以及抗腫瘤等多種藥理學功能［5-6］。然而關于雷公藤紅素對腸癌細胞干性的作用甚少見于報道。本研究以人腸癌細胞CCL-244為模型，分析了雷公藤紅素對腸癌細胞干性的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養人腸癌細胞CCL-244購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。CCL-244細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，放于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養。以下各實驗部分所用細胞均為對數生長期的細胞。

1.2 主要試劑與儀器雷公藤紅素購自上海詩丹德生物公司，純度＞98%，用二甲基亞砜（DMSO）配置成50 mmol/L備用；胎牛血清和DMEM培養基均為美國Gibco公司產品；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自AMRESO公司；Trizol、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒和通用二抗購于北京全式金生物公司；PCR引物購自上海生物工程技術有限公司；CD133、CD44、pAKT和AKT和GAPDH一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。EPS 300電泳儀購自上海天能科技有限公司，二氧化碳細胞培養箱購于美國Thermo Forma公司，半干轉系統購自美國BIORAD公司。

1.3 MTT法測定細胞體外生長取對數生長期的細胞，將細胞濃度調整為5×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中。加入不同濃度的雷公藤紅素48 h后，利用MTT法測定腫瘤細胞的活性。每孔加入10 μL MTT混勻后在37℃培養4 h。然后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，利用酶標儀測定OD492 nm的吸光度值。抑制率計算如下：抑制率=（1-OD藥物組/OD對照組）×100%。

1.4 細胞克隆形成測定CCL-244細胞經消化后以500/孔接種于6孔板中，第2天分別給藥雷公藤紅素至終濃度分別為0、1、2 μmol/L。以后每隔3～4 d替換培養基一次，培養14 d后終止實驗，使用甲醇進行固定，然后進行吉姆薩染色，在顯微鏡下計數各個孔克隆的數量。

1.5 RT?PCR法檢測基因的表達細胞經雷公藤紅素處理后，用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為第一鏈互補DNA（cDNA）。然后以cDNA為模板，采用PCR法測定細胞內CD133、CD44和Oct4基因的表達情況。內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。引物如下：CD133上游引物為5′-AGGCACTTACGGCACTCTTC-3′，下游引物為 5′-GAAGGACTCGTTGCTGGTGA-3′；CD44 上游引物為 5′-CAGCTCATACCAGCCATCCA-3′，下游引物為 5′-AGGTCCTGCTTTCCTTCGTG-3′；Oct4上游引物為5′-GCAAAGCAGAAACCCTCGTG-3′，下游引物為5′-AGCCTGGGGTACCAAAATGG-3′；GAPDH 上游引物為 5′-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，下游引物為5′-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3′。

1.6 Westernblot法檢測蛋白的表達 細胞經雷公藤紅素處理后，收集細胞并提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。按照文獻報道方法進行配膠后電泳，然后轉膜2 h后用5%牛奶封閉，一抗室溫孵育2 h后，經洗滌后用二抗孵育1 h后進行曝光并顯影。采用Western blot ImageJ對蛋白條帶進行半定量分析。

1.7 統計學方法所有數據均以平均值±標準差表示，采用SPSSOne-way ANOVA檢驗12.0統計軟件進行統計學處理，組間分析采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素抗腫瘤細胞增殖利用MTT法測定不同劑量的雷公藤紅素對腸癌細胞CCL-244增殖的影響。結果顯示，雷公藤紅素對腸癌細胞CCL-244的生長具有顯著的抑制效果，雷公藤紅素各劑量組與對照組（只有培養液）相比較，差異具有統計學意義（P＜0.05），而且隨藥物劑量的不斷增加，其抑制效果亦更加顯著（表1），提示雷公藤紅素能顯著地抑制腸癌細胞CCL-244增殖。

表1 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL-244增殖的影響Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

表1 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL-244增殖的影響Tab.1 Effects of celastrol on the proliferation of CCL-244 cells x±s

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別增殖率（%）對照組100 0.25 μmol/L 93.7±1.5 0.5 μmol/L 79.5±1.1*1 μmol/L 66.8±0.1**2 μmol/L 43.5±0.4**4 μmol/L 14.7±0.0**8 μmol/L 11.0±1.0**

2.2 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL?244克隆形成的影響用平板克隆形成實驗對雷公藤紅素抗腸癌的作用進行了研究，結果如表2所示，1和2 μmol/L雷公藤紅素處理腸癌細胞CCL-244后其克隆形成數量分別為（166.3±5.5）和（109.7±11.0），與對照組（215.00±8.9）比較，差異具有統計學意義（P＜0.01），表明雷公藤紅素能夠明顯地抑制腸癌細胞CCL-244的克隆形成。

2.3 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL?244干性相關基因表達的作用雷公藤紅素處理48 h后，RT-PCR法測定干性相關基因的表達，結果如圖1所示，與對照組比較，雷公藤紅素組細胞內的細胞干性相關的基因 CD133（P＜ 0.01）、CD44（P＜ 0.01）和Oct4（P＜0.01）mRNA水平顯著下降。

表2 雷公藤紅素處理后對CCL-244細胞克隆形成的影響Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

表2 雷公藤紅素處理后對CCL-244細胞克隆形成的影響Tab.2 Effects of celastrol on the colony formation of CCL-244 cells x±s

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別對照組1 μmol/L 2 μmol/L克隆數量215.00±8.89 166.33±5.51**109.67±10.97**

圖1 雷公藤紅素處理后對CCL-244細胞基因表達的作用Fig.1 Effects of celastrol on the expression of genes in CCL-244 cells

2.4 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL?244干性相關蛋白表達的作用結果如圖2所示，與對照組比較，雷公藤紅素組細胞內的干性相關的蛋白CD133（P＜0.01）和CD44（P＜ 0.01）均呈現明顯下降趨勢。

2.5 雷公藤紅素對腸癌細胞CCL?244信號通路的作用結果如圖3所示，雷公藤紅素作用后pAKT的表達水平顯著下降（P＜0.05），而對AKT的表達則沒有明顯影響。

圖2 雷公藤紅素處理后對CCL-244細胞蛋白表達的影響Fig.2 Effects of celastrol on the expression of proteins in CCL-244 cells

圖3 雷公藤紅素處理后對CCL-244細胞信號通路蛋白表達的影響Fig.3 Effects of celastrol on the expression of signaling pathways in CCL-244 cells

3 討論

腸癌已成為惡性腫瘤死亡的第二大因素，5-氟尿嘧啶（5-FU）迄今仍然是臨床上治療腸癌的一線藥物［7］。然而5-FU單藥治療的臨床響應率僅為15%左右，因此一般5-FU與其他臨床抗癌藥物合用以增加治療效果，如5-FU與伊立替康或者奧利沙鉑聯合使用可以使臨床響應率提高到40%左右［8］。最新研究結果顯示，5-FU與bevacizumab和cetuximab聯合使用可以使對腸癌的響應率達到60%～70%。但是對化療藥物的耐藥性仍然是提高腸癌患者生存時間的主要原因［9］。此外，5-FU與化療藥物聯合使用常常產生比較嚴重的副作用。因此，高效的抗腸癌藥物迄今為止仍然存在很大的缺口。中草藥是抗癌藥物分子的重要來源，從中草藥中也發現了很多重要的抗癌藥物，如紫杉醇等。雷公藤紅素是來源于中藥雷公藤屬植物的單體成分，具有多種生物學功能，包括抗菌、抗生育、抗炎和抗癌等［10-11］。目前關于雷公藤紅素抗腸癌機制的報道主要是抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡等［10-11］，而對雷公藤紅素對腸癌細胞干性的影響鮮有研究。

近年來研究表明，腸癌中存在腫瘤干細胞，即腸癌干細胞［3，9］。兩項獨立的研究結果顯示，腸癌組織中存在一群CD133+致瘤能力強、自我更新快的腫瘤細胞，而CD133-的腸癌細胞曾無法形成腫瘤［3-4，12］。此外，CD133+細胞在體外能夠在不分化狀態下維持培養達1年以上［11］。因此，CD133是腸癌細胞重要的“干性”標記物。近年來，越來越多的研究結果顯示，這一小群腸癌細胞除了表達CD133外，還表達其他幾種“干性”標記物，如CD44、Oct4、ALDH1 等［11，13-14］。在本研究中，以腸癌細胞CCL-244為細胞模型，對雷公藤紅素抑制腸癌細胞干性進行了研究。本研究結果表明，雷公藤紅素體外能夠抑制腸癌CCL-244細胞的生長，并且抑制細胞的克隆形成。機制研究結果顯示，雷公藤紅素能夠抑制腸癌細胞干性標記物CD133、CD44和Oct4基因的表達，降低腸癌細胞CD133和CD44蛋白的表達，表明雷公藤紅素對腸癌細胞的干性維持具有很好的抑制作用。

AKT信號通路不僅參與多種重要的細胞生理過程如細胞增殖、遷移、侵襲、分化、凋亡、血管生成等，還參與惡性腫瘤細胞的干性維持［15-16］。所以筆者還探討了雷公藤紅素是否對AKT信號通路有作用。本研究結果顯示，雷公藤紅素能夠明顯地抑制AKT的磷酸化水平，而對AKT的水平沒有影響，表明雷公藤紅素可能通過抑制AKT信號通路來抑制腸癌細胞的干性。

綜上所述，本研究結果表明，雷公藤紅素可抑制人腸癌CCL-244細胞增殖和克隆形成，這可能與抑制干性相關基因和蛋白CD133、CD44等的表達、抑制AKT信號通路有關。