結核性胸膜炎患者MAIT細胞Granzyme B免疫應答特征及其與疾病轉歸的相關性

曹志紅 蔣靜 俞珊 楊秉芬 劉艷華 安紅娟 王若 翟斐 程小星

解放軍總醫院第八醫學中心全軍結核病研究所，1全軍結核病防治重點實驗室/結核病診療新技術北京市重點實驗室，2結核四科（北京100091）

結核病（tuberculosis，TB）是傳染性疾病中第二位最常見的致死性原因［1］。據估計，2013年新發900萬例結核病，有150萬人死于結核病［2］。盡管人類結核分枝桿菌感染率很高，特別是在發展中國家，但只有5%～10%的感染者在其一生中有可能發展為活動性結核病［3-4］。結核分枝桿菌與宿主之間的相互作用在很大程度上決定了結核感染的發展和結果［3，5-7］。結核分枝桿菌主要感染肺部，但也會感染其它器官而引起肺外結核，結核性胸膜炎是最常見的肺外結核之一。黏膜相關恒定T細胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT cell）是一類表達恒定T細胞受體（TCR）α鏈的天然免疫樣T細胞，屬于進化保守的T細胞，主要分布于外周血、腸道固有層淋巴組織、肝臟和肺臟中［8-10］，受進化上保守的主要組織相容性復合物（MHC）樣分子MR1的限制。MAIT細胞可能通過生成細胞因子和細胞毒性效應分子如IFN-γ、TNF-α、IL-17和Granzyme B等在人體抵御細菌和真菌感染過程中發揮重要作用，同時還參與多種炎癥性疾病的發病過程［11］。筆者對結核性胸膜炎患者胸腔積液中MAIT細胞對結核抗原免疫應答生成的Granzyme B（Granzyme B+MAIT）情況及其與疾病轉歸的相關性進行分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年7-11月期間入住本院結核病研究所的25例首次入院結核性胸膜炎患者的胸水進行分析，其中有10例在治療1～2周后重復收集胸水，分析CD8+T細胞亞群中Granzyme B+MAIT比例。本研究獲得醫院倫理委員會的批準。

1.2 診斷標準按照2000年中華醫學會結核分會制定的《肺結核診斷和治療指南》，所有結核病患者均進行胸部X線檢查，根據癥狀、分枝桿菌涂片及培養、PCR、病理檢查、T.SPOT-TB檢測結果和治療情況綜合確診，排除使用激素或其它影響免疫功能的疾病如HIV感染、移植術后、自身免疫病等。

1.3 試劑Ficoll密度梯度淋巴細胞分離液購自GE公司（USA），RPMI 1640培養液和AIM-V無血清培養液購自GIBCO公司（USA），胎牛血清（FBS）購自四季青公司，PBS購自索萊寶公司。LEAF純化的抗人CD28單克隆抗體（克隆CD28.2）、TCR Vα7.2-FITC（Cat號：351704）和 CD161-PE-cy7（339918）單克隆抗體及各自Isotype對照抗體購自Biolegend公司，CD3-ECD單克隆抗體（A07748）購自Beckman Coulter公司，CD8-PE-cy5單克隆抗體（555368）和Granzyme B-PE（561142）單克隆抗體及其Isotype對照抗體購自美國BD公司。Golgi plug、固定/破膜試劑盒購自美國BD公司。

1.4 方法

1.4.1 人胸水單個核細胞（PFMCs）的分離收集胸水，1 h內進行分離，室溫1 800 r/min×5 min離心。棄上清，加入RPMI 1640培養液重懸，室溫1 900 r/min×7 min離心。棄上清，加入5 mL RPMI 1640培養液重懸。然后進行Ficoll密度梯度離心（室溫1 000 g，20 min）獲取 PFMCs，獲取的 PFMCs經RPMI 1640培養液充分洗滌2次后，用AIM-V無血清培養基調整細胞密度為5×106/mL，加入96孔細胞培養板，每孔約1×106個PFMCs細胞（體積200 μL）。

1.4.2 PFMCs細胞的培養及抗原刺激每孔細胞懸液中加入結核分枝桿菌H37Rv裂解液（終濃度20 μg/mL），共刺激抗體CD28 200 ng。在5%CO2、37℃孵箱中孵育16～18 h，然后加入Golgi plug 0.2 μL，4～ 6 h后細胞內因子染色。

1.4.3 熒光抗體染色取培養后細胞用含2%FBS的PBS洗滌（300 g，5 min），吸去上清。20 μl 2%FBS-PBS重懸混勻后，按抗體說明量分別加入CD3-ECD、CD8-PE-cy5、TCR Vα7.2-FITC和CD161-PE-cy7單克隆抗體，4℃避光染色30 min。再用含2%FBS的PBS洗滌（300 g，5 min）1次。加入250 μL固定破膜劑，4℃固定20 min；然后用1×破膜緩沖液洗滌一次（900 g，5 min），然后加入Granzyme B-PE單克隆抗體，4℃避光染色30 min，用1×破膜緩沖液洗滌一次，棄上清后重懸于300 μL 2%FBS-PBS中，4℃避光保存。同時采用各熒光標記的同型對照，作為染色的背景水平。

1.4.4 流式細胞分析熒光抗體染色后，用流式細胞儀（Beckman coulter FC500）分析，獲取細胞數不少于100 000個。分析MAIT細胞中Granzyme B的表達，然后采用Beckman CXP軟件進行分析。

1.5 統計學方法本文數據用（）表示，采用GraphPad Prism5軟件比較，兩組之間比較進行非參數Mann-Whitney檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者人口統計學特征本試驗共收集到25份胸水，全部都是新發結核病患者，其中男性18例，女性7例。年齡（35.32±2.64）歲。

2.2 MAIT細胞對結核抗原應答生成的Gran?zymeB比例 從流式FSC/SSC散點圖中圈出淋巴細胞，然后選取CD3+CD8+群細胞設門，再選擇Vα 7.2+CD161high細胞作為MAIT細胞，分析Granzyme B的表達（圖1A）。經結核分枝桿菌H37Rv裂解液抗原刺激后，結核性胸膜炎患者胸腔積液中GB+MAIT細胞比例為（25.34±5.37）%（圖1B）。

2.3 GranzymeB+MAIT細胞比例分組比較

2.3.1 年齡繪制Granzyme B+MAIT細胞比例與年齡的散點圖，發現沒有明確的相關性（圖2A）。將患者按年齡分成≤40歲和＞40歲兩組，各組Granzyme B+MAIT細胞比例分別為（24.58±5.46）%和（26.96±12.82）%，經Mann Whitney檢驗差異無統計學意義（U=56.5，P=0.521 5）（圖2B）。

2.3.2 性別男性和女性患者胸水中Granzyme B+MAIT細胞比例分別為（25.02±6.29）%和（26.16±11.13）%，經Mann Whitney檢驗差異無統計學意義（U=61.50，P=0.951 7，圖2C）。

圖1 Granzyme B+MAIT細胞比例Fig.1 Granzyme B+MAIT cell ratio

2.4 治療前后結核性胸腔積液中GranzymeB+MAIT細胞的變化 有10例在治療1～2周后重復收集胸水，其中7例治療效果好，Granzyme B+MAIT細胞比例明顯上升（圖3A、3B），治療前后比例分別為（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，采用配對t檢驗，差異有統計學意義（t=9.867，P＜0.000 1，圖3C）。3例治療效果不好的患者Granzyme B+MAIT細胞比例明顯低于治療效果好的患者，且治療后比例上升不明顯，治療前后比例分別為（4.23±0.54）%和（6.60±0.61）%，差異沒有統計學意義（t=2.064，P=0.175 0，圖3D）。

3 討論

PORCELLI等［12］首先在腸黏膜淋巴組織中發現并提出了MAIT細胞這一概念。人MAIT細胞在外周血T細胞中占1%～10%，其T細胞受體（TCR）由一條半恒定的Vα7.2鏈組成，與有限數量的TCR β鏈配對。人MAIT細胞可以通過Vα7.2和CD161陽性表達來識別［13-14］。與傳統的CD4和CD8 T細胞與肽抗原發生反應和CD1限制性T細胞識別含脂質的抗原不同，MAIT細胞代表了一類新的T細胞，它們可以識別由主要組織相容性復合物（MHC）樣分子MR1提呈的微生物合成的維生素B代謝物而受到激活［15-18］。目前對MAIT細胞抗感染免疫方面的研究主要集中在外周血中，對感染局部作用的研究較少。

圖2 Granzyme B+MAIT細胞比例分組比較Fig.2 Granzyme B+MAIT cell ratio comparison between groups

圖3 治療前后Granzyme B+MAIT細胞比例比較Fig.3 Comparison of the proportion of Granzyme B+MAIT cells before and after treatment

MAIT細胞在抗微生物感染中通過生成效應分子而發揮重要功能，如IFN-γ，腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-17。MAIT細胞在宿主抗分枝桿菌感染免疫中的功能主要在動物模型中進行研究，發現MAIT細胞通過產生IFN-γ能有效抑制巨噬細胞中牛分枝桿菌BCG的生長［19］。在小鼠分枝桿菌肺部感染中，MAIT細胞聚集至肺部，提供早期保護性免疫［20］。在人體中，活動性結核病患者外周血中MAIT細胞比例下降，但是在肺部和結核性腹膜炎患者的腹水中含量較高［21-22］，說明MAIT細胞能在感染部位明顯富集，而且結核性胸腔積液中MAIT細胞對結核分枝桿菌抗原的免疫應答高于外周血［23］。提示MAIT細胞可能參與局部抗菌免疫，但是MAIT細胞如何發揮抗菌活性仍然不得而知。雖然已經確定動物感染模型中MAIT細胞在對宿主分枝桿菌感染防御中起重要作用，但MAIT細胞在結核患者中的功能作用仍然很大程度上未知。顆粒酶B（Granzyme B）是一種絲氨酸蛋白酶，最常見于細胞毒性淋巴細胞（CTL）、天然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T細胞的顆粒中。它由這些細胞與穿孔素一起分泌，以介導靶細胞的細胞凋亡。有研究發現，MAIT細胞在未刺激情況下表現為靜息記憶表型，刺激后，通過上調效應分子特別是Granzyme B的表達來發揮細胞溶解等效應功能，進而在傳染病和癌癥中發揮功能［24］。

在這項研究中，筆者調查了結核性胸膜炎患者胸腔積液中MAIT細胞的免疫應答特征，經結核分枝桿菌抗原刺激后，結核性胸膜炎患者胸腔積液中Granzyme B+MAIT比例為（25.34±5.37）%。男女性和不同年齡患者的Granzyme B+MAIT細胞比例均無顯著差異。7例治療效果好的患者治療后Granzyme B+MAIT細胞比例明顯上升，治療前后比例分別為（30.41±2.78）%和（40.61±2.61）%，差異有統計學意義（t=9.867，P＜0.000 1）。3例治療效果不好的患者Granzyme B+MAIT細胞比例明顯低于治療效果好的患者，且治療后比例上升不明顯。

本研究發現結核性胸腔積液中MAIT細胞對結核抗原發生免疫應答而生成Granzyme B，而且治療有效時Granzyme B量明顯升高，說明MAIT細胞可能通過顆粒酶B的細胞毒性殺傷作用而在局部抗結核免疫中發揮重要作用。