熱性驚厥患兒核因子-κB和神經(jīng)元特異性烯醇化酶與腦損傷、心肌損傷的關(guān)系

郝改領(lǐng) 張中馥 張楠 徐麗娟 賈系群 鄭少敏

河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院急診科（石家莊050031）

熱性驚厥（febrile convulsion，F(xiàn)C）是一種兒科最為常見的驚厥類型，多發(fā)生在感染性疾病，特別是呼吸道感染，患兒體溫上升到38℃以上后可能會出現(xiàn)驚厥［1］。小兒熱性驚厥一般預(yù)后較好，但也可能會出現(xiàn)腦損傷、心肌損傷等多種并發(fā)癥。多次發(fā)作、發(fā)作時(shí)間過長、發(fā)作時(shí)體溫較低等，都是造成患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一種參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程的重要因子［4］，其作用在癲癇、心肌缺血再灌注等疾病中都深入研究，但其在小兒高熱驚厥中的研究極為少見。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）是一種評估神經(jīng)元受損程度的指標(biāo)，被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)損傷程度的評估中［3-6］，但其在小兒高熱驚厥中的研究不多。本研究分析了熱性驚厥患兒NF-κB和NSE的表達(dá)與腦損傷、心肌損傷的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年3-月，在我院急診科診斷為單純性熱性驚厥的患兒共51例，年齡6個(gè)月～7歲，平均（3.19±1.83）歲，其中男24例，女27例，納入單純性熱性驚厥組（SFS組）；選取同期診斷為復(fù)雜性熱性驚厥的38例患兒，納入復(fù)雜性熱性驚厥組（CFS組），年齡6個(gè)月～6歲，平均（3.64± 2.08）歲，男20例，女18例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒符合2016版《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識》中單純性熱性驚厥或復(fù)雜性熱性驚厥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；（2）本次發(fā)病為首次發(fā)病；（3）患兒無神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)相關(guān)疾病；（4）患兒家長了解并自愿參加本次研究，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者既往或合并有癲癇、腦部腫瘤占位、智力發(fā)育異常或其他神經(jīng)精神疾病病史；（2）患兒合并有其他器官、組織等重大疾病、惡性腫瘤等；（3）患兒有腦脊液檢查禁忌證；（4）患兒家屬不同意參與本次研究。另外選取同期在我院急診科高燒就診考慮腦膜炎，但后確診為急性上呼吸道感染的患兒共37例納入對照組，其中男18例，女19例，年齡6個(gè)月～7歲，平均（3.23±1.99）歲。3組患兒的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可以進(jìn)行研究比較。本次研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

1.2 方法熱性驚厥患兒在驚厥發(fā)作后24 h內(nèi)抽取靜脈血和腦脊液各3 mL，而對照組患兒則在入院后3 h內(nèi)抽取靜脈血和腦脊液。所有樣品均采用低速離心法，分離血清和血細(xì)胞，分布置于-80℃冰箱保存。運(yùn)用電化學(xué)發(fā)光法，采用LIAISON全自動免疫分析儀（拜耳，德國）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）測定試劑盒（北京科美生物技術(shù)有限公司）測定受試者血液和腦脊液中NSE的表達(dá)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測受試者腦脊液中神經(jīng)因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和EF手型鈣結(jié)合蛋白（SI00B）的表達(dá)水平。BDNF檢測采用上海遠(yuǎn)慕生物科技優(yōu)先公司提供的試劑盒，而SI00B檢測試劑盒由北京奧維亞生物技術(shù)有限公司提供。采用貝克曼Olympus AU2700全自動生化分析儀和南京波音特生物科技有限公司提供的心肌酶譜系列檢測試劑盒檢測受試者血液中心肌酶譜的表達(dá)水平，包括磷酸激酶同工酶（creatine phosphokinase-Mb，CK-MB）和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）。而NF-κB表達(dá)量則通過實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈鎖反應(yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction，qRTPCR）進(jìn)行檢測，運(yùn)用全血RNA快速提取試劑盒（Progema）從樣品血細(xì)胞中提取RNA，隨后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后使用SYBR-GREEN熒光定量試劑盒（Bio-Rad）在ViiA-7 Real-Time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems）上以GAPDH為參照，進(jìn)行相對定量計(jì)算分析，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)孔。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequencing

1.3 觀察指標(biāo)比較不同組患兒血液和腦脊液中NF-κB、NSE水平及腦脊液中神經(jīng)因子和血液中心肌酶譜的水平。同時(shí)分析熱性驚厥患兒血清NSE和NF-κB水平與神經(jīng)因子BDNF和心肌酶譜CKMB水平之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，3組均數(shù)的比較采用one-way ANOVA分析，每兩組均數(shù)的比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)（率）的形式表示，組間采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。相關(guān)性分析采用Pearson′s相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患兒NF?κB、NSE、神經(jīng)因子及心肌酶譜表達(dá)水平比較3組患兒的腦脊液和血液中NF-κB和NSE的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CFS組的上述指標(biāo)均為最高。但對照組和SFS組患兒腦脊液NSE的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組患兒腦脊液的神經(jīng)因子水平和血液心肌酶譜指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且CFS組最高，對照組最低。見表2。

表2 各組患兒NF-κB、NSE、神經(jīng)因子及心肌酶譜表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of the expression level of NF-κB，NSE，nerve factors and myocardial enzymes expression in different groups

2.2 血液或腦脊液NSE和NF?κB表達(dá)水平與神經(jīng)因子和心肌酶譜指標(biāo)之間的相關(guān)性分析將所有受試者的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析可見，血液中NSE和NF-κB水平呈正相關(guān)（R=0.532，P=0.007）而腦脊液中二者水平也成正相關(guān)（R=0.693，P＜0.001）。患兒腦脊液中NF-κB的水平與患兒腦脊液中神經(jīng)因子BDNF和SI00B水平均成正相關(guān)（R=0.710，P＜ 0.001；R=0.422，P＜ 0.001）。而患兒血液中NF-κB水平與患兒心肌酶譜CK-MB和LDH水平亦呈正相關(guān)（R=0.454，P＜0.001和R=0.582，P＜0.001）。見圖1。

圖1 血液或腦脊液NSE和NF-κB表達(dá)水平與神經(jīng)因子和心肌酶譜指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis between NSE or NF-κB expression in serum and cerebrospinal fluid and nerve factors or myocardial enzymes

3 討論

FC是一種常見的兒科疾病，多見于年齡6個(gè)月～3歲的幼兒，常常發(fā)生于上呼吸道感染或其他感染性疾病后，往往在驚厥前患兒體溫已上升到38℃以上且已排除顱內(nèi)感染或其他可能導(dǎo)致驚厥的器質(zhì)性病變或代謝疾病［7］。該病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，大部分患兒一般預(yù)后良好，但該病的復(fù)發(fā)率較高，且部分患兒由于多次發(fā)作后可能會轉(zhuǎn)為癲癇。目前的研究表示，患兒的發(fā)病年齡越小、發(fā)作時(shí)體溫越低、發(fā)作時(shí)間越長、次數(shù)越多等，都會導(dǎo)致較差的預(yù)后［8］。除了腦損傷外，近來的研究也提出患兒在熱性驚厥發(fā)作期間會出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂、血糖紊亂、心肌酶譜指標(biāo)異常等，提示熱性驚厥患兒在發(fā)作過程中可能發(fā)生心肌細(xì)胞損傷［9］。既往的研究和本次研究均表明復(fù)雜性熱性驚厥患兒的神經(jīng)因子表達(dá)水平和心肌酶譜相關(guān)指標(biāo)均高于單純性熱性驚厥患兒及普通上呼吸道感染患者。但目前，對其中可能存在的機(jī)制目前仍不十分明確。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞中很多重要的生理功能，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞繁殖、腫瘤生成、炎癥反應(yīng)等［10］。目前的研究已經(jīng)證實(shí)NF-κB在癲癇的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［11］，而熱性驚厥患兒亦有發(fā)展為癲癇的可能。因此，本研究就熱性驚厥患兒外周血中NF-κB的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)熱性驚厥患兒外周血中NF-κB水平顯著上呼吸道感染患兒，且復(fù)雜性熱性驚厥患兒的NF-κB表達(dá)水平較單純性熱性驚厥更高。

NSE作為一種神經(jīng)細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于預(yù)測相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后情況。癲癇患者發(fā)作后外周血中NSE水平顯著上升［12］，而研究表明熱性驚厥患兒發(fā)作后腦脊液和外周血中的NSE水平均有上升，且復(fù)雜性熱性驚厥患兒的NSE水平更高，提示患兒的腦細(xì)胞受到一定的損傷，損傷程度與驚厥發(fā)生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。除NSE外，BDNF作為一種參與神經(jīng)細(xì)胞功能維持和修復(fù)的重要蛋白，SI00B蛋白作為一種星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活標(biāo)志，均可用做評估腦損傷的標(biāo)志［13］。BDNF更參與了NF-κB信號通路的調(diào)控［14］。本研究證實(shí)在高熱驚厥患兒中NF-κB的表達(dá)水平與BDNF和SI00B呈正相關(guān)。因此，NF-κB和NSE均可作為評估高熱驚厥患者腦損傷的標(biāo)志。

此外，NF-κB也被證實(shí)參與心肌細(xì)胞損傷及心肌缺血再灌注等生理病理功能，其調(diào)控心肌中某些炎性因子，如白細(xì)胞介素8、腫瘤壞死因子-α等的釋放，激活了熱休克蛋白的表達(dá)，激活下游細(xì)胞凋亡基因Bcl-2等［15］。本研究結(jié)果也提示患兒NF-κB表達(dá)水平與患兒心肌酶譜中CK-MB和LDH指標(biāo)呈正相關(guān)。因此，NF-κB也可用于評估患兒的心肌細(xì)胞損傷程度。

綜上所述，熱性驚厥患兒NF-κB和NSE的表達(dá)水平與患兒腦損傷和心肌損傷水平呈正相關(guān)，可以考慮作為熱性驚厥患兒腦損傷和心肌損傷的評估標(biāo)志物。但因?yàn)楸敬窝芯康臉颖玖坑邢蓿芯拷Y(jié)論僅供參考，最終結(jié)論有待多中心大樣本的臨床研究。