SCN5A基因單核苷酸多態(tài)性與壯族原發(fā)性癲癇易感性的相關(guān)分析

黃建敏 陳海燕 黃清 黃靈 劉國軍 唐雄林 簡崇東 蒙蘭青 李雪斌

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣西百色533000）

癲癇遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鈉離子通道基因突變改變了該通道的結(jié)構(gòu)和功能導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電，是原發(fā)性癲癇發(fā)病的重要機制之一，并且明確鈉離子通道的編碼基因是某些特殊類型癲癇的致病基因［1］。既往認為SCN5A通道只存在于心肌細胞中，是心肌的特異性通道，并且已經(jīng)證實SCN5A基因突變與遺傳性心律失常發(fā)病密切相關(guān)［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)SCN5A通道在癲癇好發(fā)部位的大腦組織邊緣系統(tǒng)中存在廣泛表達，對人腦組織SCN5A基因cDNA進行克隆，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列和人心肌SCN5A通道氨基酸序列具有高度同源性，相同率高達98%，人腦組織膜片鉗實驗發(fā)現(xiàn)，SCN5A通道存在鈉離子電流，提示人腦組織SCN5A通道和神經(jīng)元電活動密切相關(guān)［3］，SCN5A基因突變可能與癲癇發(fā)病存在聯(lián)性。基因突變受種族、地域、氣候等因素影響，百色地區(qū)是壯族聚集區(qū)，地理環(huán)境及氣候條件特殊，可能導(dǎo)致癲癇發(fā)病機制更復(fù)雜。在心肌病患者中發(fā)現(xiàn)SCN5A基因rs6599230和rs1805126突變率較高，并且已經(jīng)明確是左心室致密化不全的高危因素［4-5］。本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)和直接測序法對百色地區(qū)壯族原發(fā)性癲癇患者SCN5A基因位點rs6599230和rs1805126多態(tài)性檢測，研究該基因多態(tài)性與壯族原發(fā)性癲癇易感性的關(guān)系，以期在基因水平探討癲癇發(fā)病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象2015年1月至2018年8月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診確診的155例壯族原發(fā)性癲癇患者。入組標準：（1）符合2001年國際抗癲癇聯(lián)盟組織制定的癲癇和癲癇綜合征的基本分類標準；（2）檢查頭顱MRI或CT等影像學(xué)，未發(fā)現(xiàn)異常；（3）年齡在18～60歲之間，三代均為壯族。排除標準：（1）暈厥、假性癲癇發(fā)作、低血糖、發(fā)作性睡病等發(fā)作性疾病；（2）患有腦腫瘤等腦部疾病，或其他神經(jīng)退行性疾病；（3）嚴重患有心、肝、腎等重要器官功能障礙；（4）有精神病史或家族史；（5）存在智力障礙的患者。另在我院體檢中心，隨機選擇200例健康個體作為對照組。入組標準：（1）血壓、血糖、血脂正常；（2）無癲癇及精神類疾病的病史；（3）入選者均非病例者親屬。本研究經(jīng)道德倫理委員會批準同意，且所有參組者均充分知情并簽署同意書。兩組在性別比例、平均年齡、體質(zhì)量等一般資料的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取所有受試者空腹抽取外周靜脈血2 mL，3000 r/min離心10 min，棄上清液后采用CWE 2100 Blood DNA Kit V2（康為世紀生物科技有限公司）嚴格按照說明書操作進行提取DNA，提出的DNA采用紫外分光光度儀測定純度后轉(zhuǎn)移至384孔板置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 位點選擇和引物設(shè)計Pubmed中檢索出SCN5A基因的全序列后利用Haploview軟件（version4.2）選取功能性rs6599230和rs1805126為研究靶點，通過Assay Designer（Sequenom公司）軟件設(shè)計引物并由上海生工工程股份有限公司合成，其中rs6599230的特異性擴增上游引物為5′-CCATTGACAAGGGAGTTGCAC-3′，下游引物為 5′-CTGCAAATGGTGTCCCTCC-3′，rs1805126特異性擴增上游引物為 5′-TCCTCATCGTGGTCAACAT-3′，下游引物為5′-GGCTCGTAGGAGATCTTGG-3′。

1.2.3 基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotide polymorphisms，SNP）檢測及分型 采用PCRRFLP及基因測序法檢測SNP類型（由北京六合華大基因科技有限公司完成）。PCR擴增：總體積30 μL，上下游引物各 1.5 μL，基因組 DNA3 μL，PCR-Mix 15 μL，去離子水9 μL。PCR 反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性3 min；95℃變性25 s，分別60.0℃，65.0℃，68.0℃退火30 s，75℃延伸25 s，循環(huán)38次；72℃延伸3 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶McrⅠ，AcyⅠ進行酶切，隨后行聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定基因型，為分型更準確性，rs6599230及rs1805126位點均采用基因直接測序法進行基因分型，根據(jù)峰圖特點判斷基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，對患者基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy?Weinberg遺傳平衡檢驗對rs6599230和rs1805126位點基因型分布頻率測量值與預(yù)測值的差異性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個位點均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（均P＞0.05），說明樣本具有代表性。

2.2 rs6599230和rs1805126位點等位基因及基因型分布頻率比較與對照組相比，癲癇組患者rs6599230位點等位基因分布（χ2=11.030，P=0.001）和基因型分布（χ2=11.147，P=0.004）的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1），而rs1805126位點等位基因分布（χ2=0.080，P=0.928）和基因型分布（χ2=0.786，P=0.675）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.3 rs6599230位點基因型與癲癇易感性的關(guān)聯(lián)性分析在癲癇組患者中，與CC+CT基因型相比，rs6599230位點TT基因型能顯著增加癲癇發(fā)病的易感性，OR值（95%CI）為1.921（1.230～ 2.998）。見表3。

3 討論

癲癇是一種以腦神經(jīng)元過度放電導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，由多種病因引起的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。癲癇的發(fā)作給患者及其家屬帶來了軀體和精神上的雙重痛苦，同時也大大增加了醫(yī)療保健的經(jīng)濟負擔(dān)，癲癇已成為當今社會重要的醫(yī)療問題。因此，對癲癇易感人群篩查及發(fā)病機制探索就顯得尤為重要。有調(diào)查結(jié)果顯示，在我國不同地區(qū)癲癇病因也不盡相同，如寧夏農(nóng)村、拉薩的癲癇病患者多數(shù)是由于近親結(jié)婚導(dǎo)致，而湖南湘鄉(xiāng)的癲癇病致病因素為腦部疾病［6］。相關(guān)基因突變是原發(fā)性癲癇發(fā)病的重要機制之一，而基因突變受遺傳、地理環(huán)境、氣候條件影響。而廣西百色地區(qū)是我國壯族聚集地，該地區(qū)屬亞熱帶氣候，每年五、六月份持續(xù)38℃高溫，鋁土礦含量極其豐富，已經(jīng)大規(guī)模開采露天暴露20余年，基于這些特殊的民族分布、季候條件和地理環(huán)境有別于其他地區(qū)，可能導(dǎo)致百色地區(qū)癲癇患者發(fā)病機制更加復(fù)雜化。

表1 癲癇組和對照組SCN5A基因位點rs6599230多態(tài)性分布Tab.1 The distribution of polymorphisms of SCN5A genes rs6599230 in epilepsy group and control group例（%）

表2 癲癇組和對照組SCN5A基因位點rs1805126多態(tài)性分布Tab.2 The distribution of polymorphisms of SCN5A genes rs1805126 in epilepsy group and control group例（%）

表3 rs6599230基因型與癲癇易感性的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 The association analysis between rs6599230 genotype and susceptibility of epilepsy例（%）

臨床上已經(jīng)明確許多原發(fā)性癲癇發(fā)病與鈉離子通道電生理功能特性有關(guān)，其發(fā)病機制與編碼鈉離子通道α亞基的相關(guān)基因突變關(guān)系密切，迄今除SCN5A基因外的各個α亞基編碼基因與原發(fā)性癲癇關(guān)系均有研究報道，發(fā)現(xiàn)癲癇患者的這些相關(guān)基因均存在突變，并且證實這些突變基因與癲癇發(fā)病機制關(guān)系密切。如Dravet綜合征的發(fā)病機制與SCN1A基因突變有關(guān)［7］，早發(fā)型癲癇性腦病的發(fā)病機制與SCN8A基因突變有關(guān)［8］。SCN5A通道是鈉離子通道的重要亞型，其基因定位在人3號染色體短臂上，研究［9］表明，SCN5A在人體心肌組織中高表達，SCN5A基因突變在心肌功能異常及心律失常中起著重要作用。另外，研究證實，SCN5A基因突變可改變鈉離子通道的電生理功能，導(dǎo)致鈉離子通道活性增高或降低，進而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能失常［10］。近年來研究［11-12］發(fā)現(xiàn)該通道在中樞神經(jīng)系中也有著廣泛的表達，尤其在人腦組織的邊緣系統(tǒng)，而邊緣系統(tǒng)又是癲癇的好發(fā)部位，所以提示該通道可能與癲癇發(fā)病關(guān)系密切。

筆者關(guān)注突變率較高的外顯子rs6599230和rs1805126兩個多態(tài)性對癲癇易感性的影響。本研究采用PCR-RFLP和基因直接測序法對155例壯族原發(fā)性癲癇患者SCN5A基因rs6599230和rs1805126多態(tài)性檢測，分析這兩個位點多態(tài)性與原發(fā)性癲癇易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癲癇組與對照組相比，rs6599230基因型分布和等位基因分布的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），癲癇組突變純合子TT基因型比例明顯高于對照組，而rs1805126基因型分布和等位基因分布的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在癲癇組中，與CT+CC基因型相比，rs6599230突變純合子TT基因型能顯著增加癲癇發(fā)病的易感性，OR值（95%CI）為1.921（1.230～2.998）。該研究結(jié)果表明SCN5A rs6599230的基因多態(tài)性對癲癇易感性有一定的影響，基因型為TT的患者比CC或CT的患者更易誘發(fā)癲癇發(fā)作。原因可能是該位點突變影響了鈉離子通道基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA表達及蛋白合成和轉(zhuǎn)運，進而導(dǎo)致鈉離子通道構(gòu)象發(fā)生改變，鈉離子通道功能異常引起神經(jīng)系統(tǒng)興奮發(fā)放及信號傳遞功能失常，導(dǎo)致了癲癇易感性增加。

本研究實驗結(jié)果證實了SCN5A基因是壯族原發(fā)性癲癇發(fā)病的易感基因，但是只局限在rs6599230和rs1805126兩個位點的獨立研究，還沒有進行連鎖不平衡分析，由于連鎖不平衡可能與癲癇的發(fā)生和表型更加密切，如單倍體TTC、CCC。因此，筆者將進行更多的SNP研究，同時進行連鎖不平衡分析，并進一步探討SCN5A基因的SNP與癲癇的表型及嚴重性的關(guān)系。