梅毒螺旋體重組蛋白rTp0608在梅毒血清學診斷中的初步應用

高飛 羅宏 談園 李麗琴 張帥 張蓮

長沙市第一人民醫院皮膚性病科（長沙410005）

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）引起的一類主要經性接觸傳播的多階段性傳染病。近年全球的梅毒發病率居高不下，已成為嚴重的公共衛生問題［1］。在中國，梅毒死灰復燃，發病率也呈逐年上升趨勢［2］。此外，盡管Tp對青霉素等抗生素非常敏感，但一些抗生素如大環內酯類在治療梅毒患者時可能出現耐藥現象［3］。目前，梅毒的診斷主要依賴于一系列血清學方法，分為非Tp抗原血清試驗和Tp抗原血清試驗。前者包括快速血漿反應素環狀卡片試驗（rapid plasma reagent test，RPR）、甲苯胺紅不加熱血清試驗（syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST）等，后者主要包括梅毒螺旋體顆粒凝集實驗（TPPA）［4］和熒光密螺旋體抗體吸收試驗（fluoresent treponemal antibody-absorption test，FTA-ABS）［5］等。雖然Tp非特異性抗原血清試驗快速、簡便，但由于靈敏性不高和（或）特異性低而只能用于梅毒初篩。目前，TPPA等使用的抗原是從Tp中提取。由于Tp難以培養，所以抗原提取較為困難［6］。相比之下，重組抗原制備具有顯著優勢，可直接從大腸桿菌培養基中大量獲得［7］。此外，目前許多重組抗原已經被報道可用于梅毒血清學診斷，如 Tp0453 和 TpF1［8-9］。以這些重組蛋白為包被抗原建立的ELISAs靈敏性高、特異性強、快速、準確、簡便、安全。但目前，尚不清楚哪個重組抗原的診斷性能最佳，建立的ELISA也尚不完全成熟，因此篩選新的免疫優勢抗原很有必要。有文獻表明［10］，假定蛋白Tp0608具有高度免疫原性，可與各期梅毒患者血清以及Tp感染兔血清發生反應。在本研究中，筆者建立了以rTp0608為包被抗原的ELISA，并將該方法與金標準進行比較。

1 材料與方法

1.1 TpDNA制備 Tp Nichols菌株由廈門大學醫學院附屬中山醫院楊天賜教授饋贈。按照LUKEHART等［11］的操作方法，將Tp Nichols菌株在成年的新西蘭兔睪丸內培養。應用QIAamp DNA minikit（Qiagen，INC.，Germany）制備Tp DNA，用于基因擴增。

1.2 血清標本從長沙市第一人民醫院皮膚科和檢驗科收集48份一期梅毒患者血清、36份二期梅毒患者血清、26份早期潛伏期梅毒患者血清、30份正常血清、5份乙型肝炎患者、5份丙型肝炎患者血清。從湖南省疾控中心收集5份鉤端螺旋體病患者血清。根據梅毒患者的血清學特點以及個人史（包括患者臨床癥狀、體征以及患者性交史）進行梅毒患者確診［12］。標本采集時已獲得患者知情同意。

1.3 Tp0608的克隆、表達及純化PCR擴增tp0608全長基因。基因tp0608引物序列：上游5′-GCGGCCGCATGGCGGATCCCTCGGCATG-3′（斜 體為NotI酶切位點）；下游5′-CTCGAGTCACTTGCCGCCAGAAACGAC-3′（斜體為XhoI酶切位點）。PCR反應體系50 μL：2×Taq酶25 μL，上下游引物各 2 μL，模板 3 μL，無酶水 18 μL。PCR 參數：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共30個循環，72℃1 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示tp0608基因目的擴增片段預期大小為891 bp。構建pET28a-tp0608-E.coliBL21原核表達系統。篩選陽性克隆，經測序鑒定后獲得重組菌。在LB培養基中以最佳表達條件30℃0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）過夜誘導 rTp0608表達。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的蛋白的表達量以及表達形式。菌體于超聲破碎后高速離心收集沉淀，充分溶解，經Ni-NTA親和層析柱純化。SDS-PAGE分析目的蛋白純度。紫外分光光度法測定蛋白濃度。

1.4 rTp0608的鑒定以及免疫反應性分析純化的目的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印至硝酸纖維素膜，1∶1 000稀釋的anti-His抗體，1∶500稀釋的羊抗兔感染兔血清，1∶500稀釋10份梅毒陽性血清、5份正常血清（陰性對照）、2份鉤端螺旋體病患者血清、2份乙型肝炎患者血清以及2份丙型肝炎患者血清為一抗，37℃孵育2 h；以1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠IgG（Millipore）、1∶12 000稀釋的羊抗兔IgG（Abcam）和1∶8 000稀釋的HRP標記的羊抗人IgG（Abcam）為二抗，37℃孵育1 h；ECL顯色，G：BOX Chemi XXX9化學發光儀上曝光顯影。

1.5 ELISA以0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋目的蛋白至終濃度為50 μg/mL。96孔板（Costar）中每孔100 μL包被過夜。次日，以0.05%Tween 20-0.01 mol/L PBS（pH 7.4）洗滌5次，每次5 min。含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉4 h。1∶500稀釋的人血清為一抗，HRP標記的羊抗人IgG（Abcam）為二抗，TMB為顯色底物，終止反應后用BioRad酶標儀測定各孔OD450值，計算正常血清標本OD450均值和標準差。血清標本OD450值≥陰性對照OD450均值±2SD者為陽性。

1.6 TPPA根據TPPA檢測試劑盒說明書，對所有梅毒患者血清、正常人血清以及交叉反應感染血清標本進行檢測并判定結果。

1.7 統計學方法不同檢測方法進行比較時，P＜0.05認為差異有統計學意義，χ2檢驗用于本實驗數據分析。

2 結果

2.1 rTp0608的表達及純化Tp0608在0.1 mmol/L 30℃過夜誘導表達后，使用金屬親和層析法純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示其為單一蛋白條帶（圖1）。

2.2 rTp0608的鑒定分別以正常人血清、Anti-His抗體、梅毒患者血清以及Tp感染的兔血清為一抗，以羊抗人IgG、羊抗鼠IgG、羊抗人IgG和羊抗兔IgG為二抗的Western blotting顯示rTp0608可與梅毒抗體陽性血清結合并在38 kDa處出現明顯的條帶（圖2）。

圖1 Tp0608表達及純化Fig.1 Expression and purification of recombinant protein Tp0608

圖2 rTp0608的鑒定Fig.2 Identification of recombinant protein Tp0608

2.3 rTp0608免疫反應性分析Western blotting

結果顯示rTp0608可被一期、二期及早期潛伏期梅毒患者血清識別，但不能被正常人血清以及交叉感染患者血清所識別（圖3），這表明rTp0608具有良好的抗原性和特異性。

圖3 rTp0608免疫反應性分析Fig.3 ImmunoreactivityanalysisofrecombinantproteinTp0608

2.4 ELISA陽性檢出率及與金標準的一致性分析本實驗中，rTp0608-ELISA陽性檢出率為97.27%，與金標準相似（表1）。此外，其與金標準比較時，一致性較好（表2）。鑒于該方法的可靠以及廉價等特點，其有望成為一種新的梅毒診斷方法。

表1 ELISA檢測梅毒患者血清特異抗體陽性率Tab.1 Positive rate of the syphilis patients detected by the ELSA

表2 ELISA與梅毒診斷金標準的一致性分析Tab.2 The agreement between the ELISA and the gold standard 例

3 討論

梅毒血清學診斷試驗可分為非Tp抗原試驗和Tp抗原試驗兩類。前者用于梅毒患者血清學活性的檢測和梅毒患者血清反應的監測；后者可用于梅毒患者的確診。非Tp抗原試驗檢測心磷脂抗原，其靈敏性和特異性受到許多因素影響。系統性紅斑狼瘡等疾病可引起抗磷脂抗體的產生，從而導致假陽性結果。TPPA和FTA-ABS等確診試驗操作復雜，嚴重依賴技術人員的水平。此外，這些試驗所使用的抗原提取復雜。上述缺點限制了其在臨床中的使用。近年來，重組抗原rTpN15、rTpN17、rTpN45和rTpN47已經用于商業診斷試劑盒的開發。但目前尚不確定哪種抗原的血清診斷性能最好，因此篩查新的免疫優勢抗原很有必要。本研究成功地擴增出全長tp0608基因片段并穩定表達rTp0608。這為研發梅毒診斷劑盒提供了有利條件。SDS-PAGE結果表明rTp0608分子量大于預測的分子量，可能是由于N端加上一個6×His標簽。SDS-PAGE結果還顯示rTp0608純度很高，可作為ELISA抗原。

目前，許多基于Tp重組蛋白的ELISAs在檢測梅毒血清標本時表現出很高的靈敏性和特異性，可用于梅毒血清學實驗室診斷［9，13-17］。本研究建立以rTp0608為包被抗原的ELISA，通過檢測110例臨床確診梅毒患者的血清標本，發現rTp0608-ELISA陽性檢出率為97.27%。rTp0608-ELISA與金標準比較時一致性較好，這表明rTp0608-ELISA有望用于梅毒的診斷。