孕晚期B族鏈球菌攜帶篩查檢測策略

孔銀波 鄧穎穎 林麗娟 方艷平 黃莉 許心怡 劉天才

1南方醫科大學檢驗與生物技術學院抗體工程研究所（廣州510515）；2南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部（廣州510515）

B族鏈球菌（group Bstreptococcus，GBS）屬于條件致病菌，可正常寄居于人體陰道和直腸［1］。由于GBS定植率受種族、年齡、區域等多種因素的影響，不同地區報道的孕婦 GBS帶菌率有差異［2，3］。20世紀70年代，GBS被證實為圍產期母嬰感染的主要致病菌［4］，近年來的研究［5］表明GBS是我國新生兒早發型感染的重要病原菌之一，已引起圍產醫學界的高度重視。為降低圍產期母嬰感染的風險，2011年中華醫學會婦產科學分會產科學組《孕前和孕期保健指南》將孕晚期35～37周孕婦GBS篩查作為產前檢查的備查項目［6］。目前GBS的篩查策略有培養法、PCR法、抗原檢測法等［7］。培養法可選用血瓊脂、顯色培養基、Todd-Hewitt肉湯培養基，PCR法也有多種商用試劑可供選擇。目前國內外關于孕晚期B族鏈球菌攜帶篩查方法的研究主要是關于各檢測方法的靈敏度、特異性的比較，然而合適的篩查策略需要考慮多種因素，目前國內外尚缺乏B族鏈球菌篩查策略的多維度研究，因此本研究將從篩查的靈敏度及特異性、檢測周轉時間（turn-around time，TAT）、檢測費用等多個維度評價幾種篩查策略的應用效果。

1 材料與方法

1.1 樣本來源收集南方醫科大學珠江醫院2017年5月至2018年4月產科門診孕晚期35～37周孕婦的陰道拭子標本共200例。其中60例為2017年5月至2018年2月用本室自建PCR法檢測GBS-DNA陽性并經測序驗證的凍存標本，140例為2018年3月至2018年4月新鮮采集的標本。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器5%羊血瓊脂平皿及GBS顯色培養基購于生物梅里埃公司，細菌鑒定和藥敏試驗分別采用生物梅里埃VITEK MS MALDI-TOF和VITEK COMPACT2。PCR試劑①購于廣東凱普生物科技公司，試劑②購于泰普生物科學有限公司，PCR檢測采用美國ABI 7500核酸擴增儀。

1.2.2 檢測方法血瓊脂培養將新鮮采集的陰道拭子接種在血瓊脂平皿上，置于5%CO2培養箱35℃培養18～24 h后，挑取灰白色、表面光滑、有乳光、圓形、多呈β溶血的可疑菌落進行涂片染色鏡檢、用血瓊脂平皿進行分純培養。分純后用VITEK MS MALDI-TOF進行鑒定，用VITEK COMPACT2進行藥敏試驗。顯色培養基培養將新鮮采集的陰道拭子接種在GBS顯色培養基上，置于5%CO2培養箱35℃培養18～24 h后，挑取淡紅至深紅色的可疑菌落進行涂片染色鏡檢、用血瓊脂平皿進行分純培養。分純后用VITEK MS MALDI-TOF進行鑒定，用VITEK COMPACT2進行藥敏試驗。PCR法核酸提取及擴增操作分別參照兩種PCR試劑的說明書進行，兩種試劑盒檢測結果不一致的樣本將PCR擴增產物進行測序驗證。

TAT統計：用實驗室信息系統軟件統計各篩查方法的TAT。

1.3 統計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計數資料采用頻數和率表示，計數資料的分析用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四種篩查方法比較140例新鮮采集的標本同時用兩種培養法及兩種PCR法篩查GBS，血瓊脂培養法檢出陽性10例，顯色培養法檢出陽性11例，PCR法①檢出陽性12例，PCR法②檢出陽性11例，用卡方檢驗對檢測陽性率進行兩兩比較，四種篩查方法的陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。有8例標本四種篩查方法結果不一致，進行測序驗證。以測序和培養結果為金標準，對四種篩查方法進行比較，結果見表1。四種篩查方法的特異度均為100%。PCR法①的靈敏度高于血瓊脂培養法和顯色培養法，PCR法②的靈敏度與顯色培養法相當。

表1 四種篩查方法比較（n=140）Tab.1 The comparison of four methods例

2.2 兩種PCR法檢測效果比較為進一步比較兩種PCR法的檢測效果，分別用兩種方法檢測60例凍存的陽性標本（本室自建PCR法檢出［8］）。結果見表2，卡方檢驗結果表明，兩種PCR法的檢測效果差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 兩種PCR法檢測效果比較（n=200）Tab.2 The comparison of two PCR methods例

2.3 培養法及PCR法的TAT、檢測費用比較血瓊脂培養法和顯色培養基培養法檢測步驟和收費標準相同。培養法及PCR法的TAT和檢測費用比較結果見表3。

表3 培養法和PCR法的TAT及檢測費用比較Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

表3 培養法和PCR法的TAT及檢測費用比較Tab.3 The comparison of test costs and TAT between PCR and culture method x±s

方法培養法（鑒定）培養法（鑒定+藥敏）PCR法TAT（h）48.1±11.2 71.9±11.7 9.9±6.1檢測費用（元）73.5 147 73.6

2.4 GBS藥敏結果分析140例新鮮采集的標本中有11例GBS培養陽性。這11株GBS的藥敏情況為：青霉素耐藥0株，克林霉素耐藥10株，萬古霉素耐藥0株。用 WHONET5.6軟件分析本院2008-2017年分離的421株GBS的藥敏情況，未發現青霉素及萬古霉素耐藥菌株，克林霉素耐藥率為35.7%。

3 討論

研究證實，對孕晚期35～37周的孕婦進行GBS篩查，并對陽性患者采取預防和治療措施，可降低圍產期GBS感染風險［9］。GBS預防和治療首選的抗生素為青霉素，對有青霉素過敏史的孕婦，可選用大環內酯類藥物或萬古霉素進行治療［10］。本研究140例新鮮采集的標本有11例GBS培養陽性，藥敏結果對青霉素全部敏感，有10例對克林霉素耐藥。用WHONET5.6軟件分析本院2008～2017年分離的421株GBS的藥敏結果，未發現青霉素耐藥菌株，克林霉素耐藥率較高。對有青霉素過敏史的孕婦，需根據藥敏試驗的結果選擇抗生素治療方案，不能僅憑經驗用藥。

近年來，有學者的研究表明PCR法鑒定的檢測陽性率高于培養法鑒定［11-12］。由于本研究的樣本例數較少，使用的檢測試劑與已報道的文獻有所不同，本研究中PCR法鑒定的陽性率略高于培養法鑒定，但這種差異無統計學意義。各廠家的PCR試劑靈敏度略有差異，臨床實驗室在使用這些試劑盒前需對其進行性能驗證，檢測性能滿足臨床要求時方能投入使用。在實際工作中，血瓊脂培養法對工作人員的鑒別能力要求更高，由于孕婦生殖道中存在多種細菌，在血瓊脂培養基上，很多其它細菌生長快速，使GBS的生長受到抑制或菌落被覆蓋而容易導致漏檢。顯色培養基能夠有效抑制雜菌生長，而GBS生長不受影響，顯色結果容易觀察，因此顯色培養基培養法是最簡單、對實驗室條件及工作人員技術要求最低的方法，基層實驗室也能完成。PCR法檢測快速、靈敏，但PCR檢測需要專有的PCR實驗室，特有的實驗設備，普通基層醫院較難開展，且無法獲得GBS菌株，無法進行藥敏試驗，由于陰道拭子標本成份復雜，可能存在PCR抑制物而導致假陰性結果，也可能存在非特異性擴增導致假陽性結果。

本研究結果顯示血瓊脂培養法、顯色培養基培養法、PCR法檢測GBS的陽性率差別無統計學意義，培養法鑒定和PCR法鑒定GBS的費用相等，PCR法鑒定GBS的TAT時間較培養法短。因此對于已建有PCR實驗室的醫院，可優先考慮PCR法篩查GBS，其檢測靈敏度和特異性能滿足臨床要求，且不增加檢測費用，TAT時間＜10 h，有青霉素過敏史的孕婦，只能選擇培養法篩查GBS并做藥敏試驗，TAT時間更長但可獲得準確的用藥指導。未建有PCR實驗室的醫院，首選顯色培養法篩查GBS，無青霉素過敏史的孕婦只需做培養法鑒定而不需要做藥敏試驗，有青霉素過敏史的孕婦則加做藥敏試驗。