類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及炎癥因子的影響

任佳 高莉 譚雪 閆明

摘要：目的? 觀察類葉升麻苷對腦缺血再灌注大鼠學習記憶及炎癥因子的影響，探討其相關作用機制。方法? 30只SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組，每組6只。采用線栓法制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注癡呆大鼠模型，通過跳臺、Y迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，采用流式細胞儀及ELISA試劑盒測定血清、海馬及皮層中白細胞介素（IL）-1α、IL-2、腫瘤壞死因子（TNF）、干擾素-γ（IFN-γ）的含量。結果? Y迷宮實驗結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠新異臂進入次數減少，其他臂進入次數增加，新異臂潛伏期增加（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，尼莫地平組和類葉升麻苷低、高劑量組大鼠新異臂進入次數增加，其他臂進入次數減少，新異臂潛伏期減少（P<0.05，P<0.01）。跳臺實驗結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠測試期潛伏期減少，犯錯誤次數增加（P<0.01）;與模型組比較，類葉升麻苷低、高劑量組大鼠測試期潛伏期增加，犯錯誤次數減少（P<0.05，P<0.01）;流式細胞儀及ELISA試劑盒檢測顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加（P<0.05，P<0.01），海馬IFN-γ含量明顯減少（P<0.05）;與模型組比較，類葉升麻苷低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、TNF含量明顯降低，血清、海馬IL-2明顯降低（P<0.05，P<0.01），海馬IFN-γ含量明顯增加（P<0.01）。結論? 類葉升麻苷可提高MCAO大鼠學習記憶能力，且可有效降低模型大鼠炎癥因子水平，其對模型大鼠的防治作用可能與抑制炎癥反應有關。

關鍵詞：類葉升麻苷;缺血再灌注;學習記憶功能障礙;炎癥因子

中圖分類號：R285.5? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2019）04-0047-05

血管性癡呆主要是指同腦血管疾病具有關聯的癡呆，因腦血管因素而形成了認知與智能等功能障礙。類葉升麻苷（Acteoside，AS）又名毛蕊花糖苷、麥角甾苷，是肉蓯蓉中一種水溶性較強的苯乙醇苷類活性成分，具有抗氧化損傷、神經保護、改善記憶、調節免疫的作用[1-2]。前期研究發現，AS可顯著改善雙側頸總動脈結扎法所致血管性癡呆引起的學習記憶功能減退和抑郁情緒障礙，并通過降低血清和腦組織丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）含量及提高谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，減少氧化應激損傷。因此，本研究采取制作大腦中動脈栓塞慢性缺血再灌注）模型[3-4]模擬血管性癡呆，從學習記憶損傷、炎癥因子表達等方面探究AS對在體動物缺血再灌注所致血管性癡呆的神經保護作用及其相關機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

清潔級雄性SD大鼠50只，體質量（360±20）g，購自新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（新）2011-0001。大鼠均飼養于石河子大學SPF級動物房，溫度20～25 ℃，12 h/12 h光照明暗交替，自由攝食飲水。

1.2? 主要藥物與試劑

AS（純度≥98%），本實驗室自制;尼莫地平片，亞寶藥業集團股份有限公司，批號170602。

1.3? 主要試劑與儀器

大鼠白細胞介素（IL）-1α高通量液相蛋白定量試劑盒，北京中原合聚經貿有限公司;大鼠IL-2高通量液相蛋白定量套裝，北京中原合聚經貿有限公司;大鼠腫瘤壞死因子（TNF）高通量液相蛋白定量套裝，北京中原合聚經貿有限公司;干擾素-γ（IFN-γ）ELISA測定試劑盒，上海江萊生物有限公司。XR-XY1032 Y迷宮視頻分析系統（上海欣軟信息科技有限公司），YLS-3TB跳臺記錄儀（濟南益延科技發展有限公司），流式細胞儀、Go1510全波長酶標儀（Thermo Fisher），Allegra 64R離心機（BECKMAN），TL2010S高通量組織研磨儀（SOP-EQ036）。

2? 實驗方法

2.1? 造模

10%水合氯醛腹腔注射300 mg/kg麻醉，去除頸前鼠毛并消毒。沿頸部正中切開，在右側肩胛舌骨和胸鎖乳突肌形成的三角處，以止血鉗鈍性分離，暴露頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）。結扎ECA分支枕動脈、甲狀腺上動脈及ECA終末支，分離ICA顱外分支翼腭動脈。將ECA結扎并剪斷，把ECA遠心端拉直與ICA成直線，并在分叉處松松結扎一根4-0絲線。用動脈夾夾閉CCA、ICA，在ECA上剪一小切口。移去CCA上的動脈夾，縫合皮膚。假手術組大鼠只分離CCA、ECA和ICA，不插入栓線。MCAO大鼠麻醉清醒后，參照Longa等[5]及Bederon等[6]的5分制評分方法對實驗大鼠的神經行為學進行評分，2～4分者納入實驗。

2.2? 分組和給藥

造模完成后，按照大鼠體質量及神經行為學評分雙因素對模型大鼠進行篩選分組，選取造模成功大鼠30只。假手術組6只，將其余造模成功24只大鼠隨機分為模型組、尼莫地平組（12.5 mg/kg）、AS低劑量組（6.25 mg/ kg）、AS高劑量組（12.5 mg/kg），每組6只。各給藥組予相應劑量藥液灌胃，假手術組和模型組予等體積超純水灌胃。給藥體積0.1 mL/100 g，每日1次，連續21 d。

2.3? 行為學測試

2.3.1? Y迷宮實驗

Y迷宮訓練：新異臂被隔板擋住，大鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓練結束后，大鼠被放回飼養籠。Y迷宮檢測：訓練結束后4 h進行，抽開新異臂隔板，大鼠由起始臂放入，在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min內每只大鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數。統計并分析大鼠在各個臂停留時間占總時間百分比、進入次數及新異臂潛伏期。

2.3.2? 跳臺實驗

在開展實驗前，將大鼠放入跳臺儀的反應箱內適應環境3 min。跳臺訓練：用手抓住大鼠背部放在跳臺箱的平臺上，然后立即通36 V交流電，訓練5 min，記錄計時開始至大鼠第1次跳下平臺遭受電擊的時間（潛伏期）及大鼠下臺遭受電擊的次數（錯誤次數）作為學習成績。跳臺測試：訓練結束后24 h測試其記憶能力，記錄潛伏期及即錯誤次數，作為記憶成績。

2.4? 指標測定

行為學實驗結束后，腹主動脈取血，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取血清分裝后置于-80 ℃保存。冰上剝離大鼠腦組織，分離出海馬及皮層，分別制成10%、20%腦組織勻漿，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液分裝后置于-80 ℃保存。取血清、20%海馬及皮層，流式細胞儀檢測IL-1α、IL-2、TNF含量;ELISA檢測10%海馬及皮層IFN-γ含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3? 統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析，實驗數據以x（—）±s表示，采用方差分析及多組間均數兩兩比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

4? 結果

4.1? 類葉升麻苷對模型大鼠Y迷宮實驗測試指標的影響

模型組大鼠新異臂進入次數顯著低于假手術組（P<0.01），各給藥組大鼠新異臂進入次數顯著高于模型組（P<0.05，P<0.01）;新異臂停留時間占總時間百分比差異雖無統計學意義（P>0.05），但存在趨勢，模型組相對較低;模型組大鼠新異臂潛伏期顯著高于假手術組（P<0.01），各給藥組大鼠新異臂潛伏期顯著低于模型組（P<0.01），起始臂進入次數低于模型組;模型組大鼠其他臂進入次數顯著高于假手術組（P<0.01），各給藥組大鼠其他臂進入次數明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01）;起始臂及其他臂停留時間占總時間百分比各組間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。

4.2? 類葉升麻苷對模型大鼠跳臺實驗測試指標的影響

模型組大鼠潛伏期較假手術組明顯降低（P<0.01），各給藥組大鼠潛伏期顯著高于模型組（P<0.05，P<0.01），結果見圖1。模型組大鼠犯錯誤次數較假手術組明顯增加（P<0.01），各給藥組測試期大鼠犯錯誤次數較模型組明顯減少（P<0.05，P<0.01）。結果見圖2。

4.3? 類葉升麻苷對模型大鼠血清、海馬及皮層白細胞介素-1α、白細胞介素-2、腫瘤壞死因子和干擾素-γ含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯增加，海馬IFN-γ含量明顯減少，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，AS低、高劑量組大鼠血清、海馬和皮層IL-1α、IL-2、TNF含量明顯降低，海馬IFN-γ含量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），尼莫地平組大鼠血清IL-1α、IL-2含量明顯降低，海馬和皮層IL-2、TNF含量明顯降低，海馬和皮層IFN-γ含量明顯增加，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見圖3～圖6。

5? 討論

本實驗采取MCAO方法建立血管性癡呆大鼠模型，模擬血管性癡呆的發病過程，觀察AS對血管性癡呆的影響。Longa神經體征評分對腦缺血造模成功的判定是一種客觀、準確且簡便的方法，凡表現病理性神經體征的大鼠均造模成功。Y迷宮實驗主要研究嚙齒類動物的空間識別記憶能力，該迷宮利用了嚙齒類動物對新異環境天然探究的自然習性，不需要動物學習任何規則趨利避害，能有效反映動物對新異環境的識別記憶能力。根據Y迷宮實驗結果可知，模型組大鼠對新環境的識別能力下降，而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著提高該能力，增強大鼠對新環境的探索及記憶能力。跳臺實驗主要考察動物的被動記憶能力，模型組大鼠跳臺實驗潛伏期顯著高于假手術組且犯錯誤次數明顯增加，而尼莫地平組和AS低、高劑量組可顯著增加潛伏期并減少犯錯誤次數，說明AS能夠明顯改善大鼠學習記憶功能障礙。

腦缺血再灌注損傷后大腦會產生一系列病理變化，包括自由基生成增多、神經細胞凋亡、Ca2+水平失衡，炎癥反應等，其中炎癥反應是腦缺血損傷的重要機制之一。IL-1是一種常見的致炎因子，其中IL-1α作為一種重要的促炎因子，參與機體抗微生物感染、無菌炎癥以及部分自發炎癥的調節，IL-1α可促進炎性介質和氧自由基的釋放，作用于腦組織血管內皮，引起腦水腫，并產生一系列級聯放大的炎癥反應，最終導致腦組織損傷。IL-2是一種激活T細胞并維持T細胞分化和增殖的T細胞生長因子，同時也參與炎癥或自身免疫性反應。IL-2不僅可以刺激活化T細胞分泌淋巴因子，參與機體的免疫調節作用，而且可增強T淋巴細胞、單核細胞的細胞毒性。研究發現，IL-2可抑制降鈣素基因相關肽（CGRP）的合成和釋放，而CGRP能拮抗ET從而引起腦血流量的減少[7]。甘佳樂等[8]研究發現，MCAO大鼠模型可導致IL-2顯著增多，從而產生炎癥反應。本實驗結果顯示，尼莫地平及AS均可顯著降低血清IL-1α、IL-2的含量，而AS還可明顯減少海馬及皮層IL-1α、IL-2的含量，說明AS較尼莫地平對腦組織中炎癥因子具有更為明顯的作用。TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一，但其在高濃度時會誘導炎癥反應，導致一些如膿毒性休克等病理結果。研究發現，AS可顯著降低大鼠血清、海馬和皮層TNF含量，而尼莫地平組僅可降低皮層中TNF含量，這可能與2種藥物作用機制不同有關，AS改善大鼠缺血再灌注的作用可能與調節炎癥因子的作用途徑更相關，而尼莫地平主要通過舒張血管、改善腦部微循環起作用[9]。IFN-γ是一種高效的抗病毒生物活性物質，并可增強NK細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用[10]。AS主要增加血清及海馬中IFN-γ含量，對皮層中IFN-γ含量影響不大，這可能與AS的作用靶點和靶點劑量敏感性不同以及腦內血液循環等相關，有待進一步研究。

本實驗結果表明，與模型組比較，AS可明顯改善模型大鼠的學習記憶功能障礙，顯著降低血清、海馬及皮層IL-1α、IL-2及TNF含量，并增加IFN-γ含量。因此，AS可能是通過抑制腦缺血后炎癥反應，對機體產生免疫調節作用，從而起到保護神經細胞的作用，改善缺血再灌注損傷，進而發揮其神經保護及改善學習記憶能力的作用。

參考文獻：

[1] 羅嘉楠，高莉，黃晏，等.類葉升麻苷對β-淀粉樣蛋白聚集影響的體外研究[J].新疆醫科大學學報，2017，40（2）：220-223，228.

[2] 高莉，彭曉明，霍仕霞，等.類葉升麻苷對缺糖缺氧誘導PC12細胞損傷的保護作用[J].中成藥，2015，37（8）：1821-1823.

[3] 尹軍祥，田金洲，黃啟福，等.MCAO擬血管性癡呆大鼠模型的建立[J].中國病理生理雜志，2003，19（8）：137-140，150.

[4] 張秀麗，孟盼，向韻，等.補陽還五精簡方的體外篩選及體內驗證研究[J].中國中醫藥信息雜志，2017，24（2）：49-54.

[5] LONGA E Z，WEINSTEIN P R，ARLSON S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84.

[6] BEDERSON J B，PITTS L H，TSUJI M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17（3）：472.

[7] 盛樹力，張萬江，伍潔，等.降鈣素基因相關肽對腦血管和腦血流量的影響[J].首都醫學院學報，1990，11（14）：259-265.

[8] 甘佳樂，劉敬霞，黑長春，等.回藥扎里奴思方對大腦中動脈閉塞模型大鼠白細胞介素-6、-2含量的影響[J].中國老年學雜志，2017，37（7）：1576-1579.

[9] 張枝雪，黃茜，李玥，等.尼莫地平對MCAO/R模型大鼠不同時間點血流灌注量的影響[J].中國民族民間醫藥，2017，26（7）：42-45.

[10] 方明，張國慶.清氣化痰湯加減聯合西醫治療急性期COPD療效觀察及對血清INF-γ、TGF-α的影響[J].中藥材，2018，41（4）：992-994.

（收稿日期：2018-08-29）

（修回日期：2018-09-24;編輯：華強）