血清miR-223、IL-8聯合檢測在骨肉瘤診斷中的應用

張 健,王金有,劉澤華,范洪武,梁鉑堅，呂佳音

(吉林大學中日聯誼醫院 骨關節與運動醫學科,吉林 長春130033)

骨肉瘤為惡性程度較高骨腫瘤,臨床上常見,目前發病年齡具有年輕化的趨勢,10歲-25歲為該疾病的主要發病年齡段,年發病率可達3/100萬。早期轉移是該疾病的特點,約50%的患者在開始診治時已經發生遠處轉移,預后較差。侵襲轉移和遠處血行轉移為主要的播散方式。最常見的轉移臟器為肺部轉移,因早期無明顯的臨床癥狀,出現肺轉移后5年生存率在30%以下。因此在早期診斷是提高生存率的重要方式。微小RNA(miRNA)是具有調控功能的非編碼RNA,不同功能miRNA作用于不同的靶向基因,調控基因的表達。在腫瘤的發生發展過程中,miRNA發揮重要的調控作用。IL-8是能夠趨化誘導中性粒細胞的炎性介質,促進炎癥反應的過程。近來研究發現,其在多種腫瘤中呈高表達狀態[1]。本次研究血清 miR-223在骨肉瘤患者中的表達及臨床意義,探究血清IL-8與miR-223聯合檢測應用于骨肉瘤早期診斷的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年9月至2018年6月我院及協作醫院收治的骨肉瘤患者38例(男12例,女26例,年齡15.45±4.20歲),均行根治性骨肉瘤切除術,收集骨肉瘤組織。病例納入標準：①骨肉瘤的診斷參考《SEOM clinical guidelines for the treatment of osteosarcoma in adults》[2]；②臨床資料準確且完整,未進行放療或者化療。③由2名病理醫師確定病理診斷。另選取同期健康體檢者38例(男16例,女22例,年齡17.89±4.93歲)進行對照研究,所有參與者簽署知情同意書,同時排除具有可能影響檢測結果合并其他疾病的患者。

1.2 檢測方法

①實時熒光定量PCR檢測miR-223的含量。各稱取50 mg腫瘤組織以及癌旁組織,液氮研磨,提取總RNA(Trizol)；RNA核酸定量儀定量并保存于-80℃的環境下。采用北京博奧森生物技術有限公司的反轉錄試劑盒,按要求配制逆轉錄反應體系。qRT-PCR采用miScrpt SYBR Green PCR kit方法檢測,并按照操作要求配制反應體系。miR-2的上游引物序列為5’-CATGGCATCTGTCTGGCTGCC-3’下游引物5’-AACTCTTGCAATTTGGTC-3’；內參U6上游引物序列5’-CTCGCTGGCAGACAGAC-3’,下游引物序列5’-AACGCTTGACATGGGAAAT-3’,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。95℃條件下預變性5 min,95℃ 10 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共進行40個循環變性和延伸后收集。反應條件：78℃ 20 s。采用2-△△Ct計算相對基因表達量。②ELISA檢測血清IL-8的含量。空腹采取肘部靜脈血5 ml,離心去上清,按照試劑盒操作說明書進行檢測,試劑盒購自上海寶龍生物科技有限公司。

1.3 統計學分析

2 結果

2．1 血清中miR-223和IL-8在兩組中的表達

骨肉瘤組的血清miR-223表達明顯降低,與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。骨肉瘤組的血清IL-8的表達明顯高于對照組,組間比較具有統計學差異(P<0.05)。見表1。經Spearman相關分析顯示,二者之間呈低度相關(r=0.318,P<0.05)。

2．2 骨肉瘤組miR-223和IL-8的表達與相關因素關系

分析骨肉瘤患者的臨床因素,結果顯示,miR-223和IL-8的表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關,差異無統計學意義(P>0.05),而不同轉移情況的患者的miR-223和IL-8表達量組間均具有統計學差異(P<0.05)。

表1 骨肉瘤組與對照組的miR-223與IL-8的 表達

表2 骨肉瘤組織miR-223和IL-8的表達與臨床病理的 相關分析

*P<0.05**P<0.01

2.3 ROC曲線分析特異度和敏感度

圖1所見,采用 SPSS 21.0 繪制ROC的曲線圖顯示,miR-223、IL-8以及二者聯合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937,提示二者聯合檢測的效能可能高于miR-223和IL-8單一檢測(P<0.05)。以約登指數(敏感度+特異度-100%)最大為原則,選擇最佳截斷值為診斷界值,得到敏感度及特異度，并計算準確度。見表3。

圖1 miR-223、IL-8以及二者聯合的ROC曲線分析

3 討論

骨肉瘤的診斷主要包括X線、CT、MRI等放射手段以及血清的堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶檢測,但由于骨肉瘤早期常無明顯的癥狀,故在常規體檢中很難發現骨肉瘤[3]。往往在出現臨床癥狀或者確診骨肉瘤時,大多患者已出現轉移,延誤醫治。因此,尋找敏感度高、特異度強的檢測方式具有重要的臨床意義。miRNA 在真核生物中廣泛存在,外周血清中性能穩定且耐酶降解、耐酸、耐堿、耐低溫,因此為miRNA成為腫瘤標志物用于檢測提供了必要的前提。研究顯示,miR-223在多種腫瘤中的表達出現異常[4,5]。在骨肉瘤的研究中,多個miRNA包括miR-7、miR-10b、miR-181、miR-190、miR-214等被認為參與了骨肉瘤的發生、侵襲、轉移[6],miR-223也是其中重要一員[7-10]。本次研究顯示,骨肉瘤組血清miR-223表達明顯降低,與對照組比較差異具有統計學意義。經進一步對比臨床資料分析,miR-223表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關,而不同轉移情況患者的miR-223表達量具有統計學差異,即miR-223在有腫瘤轉移的骨肉瘤患者中有更低的表達,其差異具有統計學意義,這提示在骨肉瘤的發生發展過程中miR-223表達的下降可能是其關鍵的環節。此前,Dong等人的研究也得出近似的結論,他們在研究中發現,miR-223可以抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲,與miR-223高表達的患者相比,miR-223低表達患者的存活時間顯著縮短[11]。這可能意味著miR-223有望成為早期篩查和診斷骨肉瘤以及判斷預后的新的標志物。

表3 血清miR-223和IL-8檢測骨肉瘤的敏感度和特異度

在腫瘤的生長過程中,炎性介質同樣發揮了重要的作用[12,13]。如IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子參與了腫瘤的侵襲、轉移。魯俊杰等的研究發現,IL-8表達異常與骨肉瘤發生發展密切相關[14],IL-8的高表達是骨肉瘤進展的重要依據,對疾病的診斷以及病情的評估具有重要的價值[15]。劉濤等研究顯示,IL-8 在循環腫瘤細胞自我種植促進人骨肉瘤細胞增殖及轉移中發揮著重要作用,可為骨肉瘤患者早期診斷和治療提供一個新的策略[16]。本次研究顯示,骨肉瘤組的血清IL-8的表達明顯高于對照組,組間比較具有統計學差異。其表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤組織類型無關,而在轉移情況上表達量的組內比較具有統計學差異,這與上述報道一致。因此,IL-8也可作為骨肉瘤診斷的標志物之一。

由于考慮到惡性腫瘤的檢測和診斷過程中,漏診可能導致的不良后果,我們按照“并聯”診斷的原則,即任一指標為陽性者即診斷為陽性,以此來判斷聯合檢測的結果和價值,并同時對比分析了二者單獨檢測對骨肉瘤診斷的結果和價值。分析結果顯示miR-223、IL-8以及二者聯合的曲線下面積(AUC)分別為0.900、0.763、0.937。二者聯合檢測較任一單一檢測在敏感度上有了較大幅度的提升,而特異度僅有較小幅度的下降。這點在疑似骨肉瘤患者的早期篩查及診斷方面,有效地減少了漏診的幾率,對臨床腫瘤早發現、早診斷、早治療具有重要的意義,但由于其偏低的特異度,我們認為在臨床實際應用中,尚需要結合其他診斷方式進一步排查,避免誤診。由于本次研究的樣本數量有限,病患來源相對集中,miR-223診斷的準確性、miR-223與IL-8之間的相關性、聯合診斷的可靠性以及是否還有其他更具臨床價值的聯合檢測手段等還需更大樣本量進一步實驗證實。

本次研究表明,骨肉瘤患者血清miR-223表達下調,與對照組具有統計學差異,有望成為骨肉瘤分子診斷的重要標志物。miR-223和IL-8聯合檢測具有較高的敏感度,能夠有效減少漏診的幾率,提高臨床中對骨肉瘤的早期發現和診斷能力,可能成為新的臨床篩查、診斷的有效手段,而且可能成為判斷骨肉瘤患者預后的一項有效指標。