3M組織膠和電凝止血在尿毒癥大鼠腎切除的應用

黃海燕，李福記，林 鵬，廖蘊華

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021)

慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)是一個全球性的公共衛生問題，隨著人口老齡化以及社會經濟的發展，慢性腎病發病率逐年上升。據調查，我國18歲以上成年人群中的CKD的患病率為10.8%[1]。終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)是各種腎疾病的最終發展趨勢。而死于慢性腎病及其并發癥的病例越來越多。流行病學報道，至2016年，全球每年有超過2100萬起CKD事件，2.76億起流行病例，近120萬起病例死于CKD，3500萬起因CKD喪失健康生活[2]。目前慢性腎病的發病機制仍不明確，發病后對機體的影響研究仍需要不斷的進行。人體的研究常受到諸多不可控因素的影響。所以，慢性腎功能衰竭的動物模型成為研究慢性腎病的重要補充。目前制作慢性腎衰竭的方法有物理方法和化學方法。其中物理方法中腎大部分切除由于更接近臨床實際、簡便易行、穩定性重復性好等優點被人們廣泛應用[3]。在腎大部分切除模型中，迅速而有效的止血又是模型成功的關鍵。目前的止血方法有縫合止血法、電凝止血法、生物膠止血法、止血藥物止血、壓迫止血。腎屬于深部器官，壓迫止血難以達到效果。同時它是血運豐富、脆性大的實質性器官，縫合止血極易產生針眼、組織切割破損，造成針眼出血或裂口出血等不良反應，對于動物模型腎止血困難、術后并發癥多，所以縫合止血成功率低[4-5]。生物膠和電凝止血法相對于其他止血方法，手術成功率高，止血效果確切。本研究旨在比較3M組織膠止血和電凝止血在建立慢性腎疾病中的應用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠80只，體重(200±20)g，購于廣西醫科大學廣西實驗動物中心[SCXK(桂)2014-0002] [SYXK(桂)2014-0003]。飼養條件：溫度25℃，濕度40%～60%，晝夜循環各12 h，標準高壓消毒飼料，不限制進食和飲水。本實驗操作符合實驗動物福利與倫理委員會相關要求(福利倫理審查號201702002)。

1.2 實驗材料

3M組織膠購買于 Minnesota Mining and Manufacturing(USA)，型號1469SB，規格3 mL液體。異氟烷購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。氣體麻醉機由廣西醫科大學實驗動物中心提供(深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產)。

1.3 實驗方法

1.3.1 尿毒癥模型的建立

動物隨按隨機數字表法分為兩組，A組：3M組織膠止血(n=40)，B組：電凝止血(n=40)。適應性喂養一周后開始試驗。采用5/6腎切除制作尿毒癥大鼠模型。A組：異氟烷氣體麻醉成功后，右側臥位，常規備皮，消毒、鋪巾。在左側肋下1 cm、脊柱肌肉往腹部方向旁開0.5 cm行約1 cm的縱行切口，依次打開皮下組織、肌肉層，暴露左側腎，分離腎組織，剝離腎包膜，止血夾夾住腎蒂阻斷血流，按雙腎體重占大鼠體重的0.74%，切除腎上下極各1/3并稱重，用3M組織膠水2～3滴(約0.1～0.15 mL)滴于切口，數秒后膠水自然風干，觀察上下兩極切口均無出血后逐層縫合傷口，術后肌肉注射青霉素鈉40萬單位。B組：按上述同樣的方法暴露左腎并切除左腎上下極各1/3并稱重，切面使用電凝徹底止血，觀察無出血后逐層縫合傷口。所有大鼠左腎2/3切除后一周，同樣的方法切除右腎，術后肌肉注射青霉素鈉40萬單位。

1.3.2 實驗觀察指標

分別記錄兩組實驗過程中實際左腎切除的出血量、左腎蒂阻斷血流的時間。同時記錄1周、2周、3周、4周的死亡數。觀察各鼠手術后精神狀態、食量、毛色等一般情況。分別采用內眥采血法采取各大鼠術前、術后1月的血檢測血尿素氮、肌酐。收取大鼠24 h尿并檢測24 h尿蛋白定量。

1.3.3 標本采集及處理

采血后以3000 r/min離心分離血清。送本院檢驗科檢測血清肌酐、尿素氮。同時測定24 h尿蛋白定量。在二次手術后6月兩組大鼠各取5只處死，左側殘腎用 4%中性甲醛緩沖液浸泡后，石蠟包埋切片，行HE染色。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 動物模型的構建情況

兩組大鼠手術前內眥靜脈血測肌酐及尿素氮，作為正常值。在二次腎切除術后1月和8月再次內眥采血測血肌酐及尿素氮，二者達到術前2～3倍為造模成功[6-7]。術后各存活鼠逐漸出現精神萎靡，食量下降，弓背蜷縮，活動量下降，毛色干枯、疏松不齊、無光澤。

2.2 兩組大鼠術后存活率

A組和B組術后1周內大鼠存活數量分別是38只和32只，存活率分別為95%(38/40)和80%(32/40)，差異有統計學意義(P<0.05)。術后2周內存活數量分別是38只和30只，存活率分別是95%(38/40)和75%(30/40)，差異有統計學意義(P<0.05)。3周內存活數量分別是38只和27只，存活率分別是95%(38/40)和67.5%(27/40)，差異有統計學意義(P<0.05)。四周內存活數量分別是38只和27只，存活率分別是95%(38/40)和67.5%(27/40)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 左腎阻斷血流時間以及出血量的評估

左腎阻斷血流時間以及出血量的評估見表1，兩組差異有統計學意義。

2.4 腎功能檢測指標

兩種手術止血方法術后血清尿毒氮及肌酐水平。見表2，根據Zareie等[7]報告結果為正常大鼠的2～3倍為造模成功，本研究兩種止血方法的大鼠尿毒癥模型制作均成功。

2.5 腎組織病理學改變

兩種手術止血方法大鼠殘余腎腎小球缺血皺縮，球囊粘連，部分腎小球代償性增加，結構紊亂，腎小管內可見蛋白管型，小管間質纖維化，腎間質可見大量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.6 尿蛋白定量

術前24 h尿蛋白定量(10.66±4.26)mg/24 h，術后測24 h尿蛋白定量(83.90±109.78)mg/24 h。

3 討論

本研究表明，兩種止血方法均成功制作慢性腎衰竭大鼠尿毒癥模型。3M組織膠在制造慢性腎衰竭動物模型腎切除術中，術后存活率高于電凝止血。腎蒂血流阻斷時間、手術時間、術中出血量均低于電凝止血。

3M組織膠水是一種氰基丙烯酸正丁酯粘合劑，具有聚合熱低、粘接強度高、生物組織相容性和擴散性能好，在水或血液中的陰離子作用下迅速固化成和人體組織韌性相近的生物薄膜等優良特點[8-9]，具備在聚合過程中抑制細胞生長、低炎癥反應、可以降解的特性[10-11]。該類型粘合劑在人體中有報道研究主要應用在皮膚等表淺部位的粘合，也有用于頭頸部手術的粘合。其在皮膚縫合中的效果以及安全性與縫線縫合的相當，但是手術時間卻明顯縮短，這與本研究觀察到的現象一致[12]。

表1 左腎血流阻斷時間和出血量

注: 與3M組織膠組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the 3M vetbond tissue adhesive group，*P<0.05.

表2 兩組血肌酐及尿素氮對比

注：術后兩組血肌酐及尿素氮均升高，達到大鼠尿毒癥模型標準。

Note. The serum creatinine and urea nitrogen of the two groups were increased postoperation, which reached the standard of animal uremia model.

注： A為3M組織膠組，B為電凝組。兩組均可見腎小球缺血皺縮，小管間質纖維化，有炎細胞浸潤。圖1 腎組織病理學改變(HE染色，×100,×400)Note. A is for the 3M vetbond tissue adhesive group and B is for the electrocoagulation group. In both groups, glomerular ischemic shrinkage, tubular interstitial fibrosis, and inflammatory cell infiltration were observed.Figure 1 Pathological changes of the kidneys(HE staining)

電凝是利用高頻電流對組織產生熱效應，使受熱組織局部溫度升高，致使組織細胞變性、壞死、干燥、氣化、碳化，達到止血和分離作用[13]。其利用高頻高壓電弧切割并電凝止血,對生物組織熱損傷十分嚴重[14]。

本研究中，從血清肌酐、尿素氮以及腎病理結果表明兩種止血方法制作大鼠5/6腎切除尿毒癥模型均成立。組織膠止血和電凝止血均是目前主流的止血方式，本研究表明組織膠止血展現出了明顯的優勢。組織膠止血組在出血量、腎血流阻斷的時間、術后死亡率均較電凝止血法低。病理結果提示3M組織膠組創面愈合良好，炎癥細胞浸潤少。 Espin等[15]報道組織膠和可吸收線縫合在胃大部分切開術縫合中組織病理以及炎癥指標上無明顯差異，但是組織膠組手術時間明顯縮短。同樣，本研究結果與臨床上部分切除術的觀察結果相似[16]。Sultan[17]報道稱組織膠在顱骨手術中也同樣顯示出了操作簡易、安全、物美價廉等方面的優點。報道稱含該類有效成分的生物膠在使用后6月在大鼠體內降解[18]，研究人員在術后8月解剖大鼠時也發現手術切面無生物膜包裹，考慮為已降解。

相對3M組織膠止血，電凝止血存在一些缺點，創面滲血常導致止血困難，電灼使腎切面布滿焦痂，創面的滲血需要電凝刀尖反復點灼，這個過程又將焦痂扯開，焦痂的脫落增加新的出血創面，反復的電灼導致殘存腎皮質髓質的進一步損傷，破壞殘存腎的血供影響實際殘存腎單位數量和功能。這可能是電凝止血組死亡率高的主要原因之一。此外，反復不斷的對傷口進行燒灼止血，燒灼過程中不斷的刮擦電凝刀頭上的焦化組織也可能會增加感染的風險。而3M組織膠是一種生物制劑，有效成分氰基丙烯酸酯類，其聚合快速、熱量低、粘合性高、組織相容性好，固化成膜固化時間10 s[19]。止血時間通常被認為是止血性能研究中最為直觀和常見的評價指標，出血量也是反映止血效果的重要指標[20]。本研究表明，3M組織膠無論在止血時間還是出血量上均優于電凝止血。已經有證據表明氰基丙烯酸酯抗菌作用，尤其對革蘭陽性菌[21-23]。組織膠組術后死亡率低，也可能是其有效成分具有抗菌作用有關系。

其次，從經濟學角度來看，3M組織膠每瓶3 mL，市場價格300元左右，且購買渠道廣泛，容易獲得，另外，使用過程中不需要配備特殊的儀器設備，一定程度上可以有效地將成本降低。而電凝止血需要專門配置相應的電凝設施，其配套設施價格昂貴，且使用過程中電凝設備的耗損也進一步引起成本增加，這對于經濟條件受限的單位和個人都是不容忽視的問題。所以，3M組織膠止血對于電凝止血無論是在科學角度還是經濟角度均占優勢。

此研究具有一定的應用價值，目前進行的慢性腎功能不全的實驗研究中，如何保護腎功能、延緩甚至逆轉腎功能的進展是一個熱門話題[24]。那么成功的制作慢性腎功能不全的模型是尤為重要。而在手術切除腎制作該模型中，安全有效的止血是關鍵。本研究表明，3M組織膠的止血效果優于電凝止血。且在經濟學角度看來，性價比更高。