低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞環(huán)狀RNAs的生物信息學分析

郝文革 孫遜沙 吳潔瑩 陳勁松 喻秋霞 李 焱 吳韶清

1 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 2 中山大學附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 3 中山大學附屬第一醫(yī)院(廣州 510080)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)為普遍存在于人體各組織中的成體干細胞，具有自我更新、多向分化潛能、免疫抑制和易于轉(zhuǎn)染的特性，是再生醫(yī)學的理想種子細胞和基因治療載體[1-2]。MSCs作為第二種用于臨床治療的成體干細胞，已有多種間充質(zhì)干細胞藥物用于臨床疾病的治療，而更多的臨床前和臨床研究正在進行。目前，在Clinicaltrials上登記的臨床試驗864項。臨床和臨床前研究主要使用骨髓源間充質(zhì)干細胞。同骨髓源間充質(zhì)干細胞比較，人胎盤源間充質(zhì)干細胞易于分離提取，胎盤體積大，沒有倫理障礙，而且因胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細胞擴增潛能更好而成為一種理想的間充質(zhì)干細胞來源[3-5]。

已有研究表明，間充質(zhì)干細胞的生物學特性受分離培養(yǎng)過程中多種因素的影響。其中，低氧預處理對間充質(zhì)干細胞的細胞周期、增殖、凋亡、遷移和分化都有一定的影響[6-7]。但是其分子機制有待進一步研究。環(huán)狀RNAs涉及到多種細胞的生物學特性，但是其在低氧預處理間充質(zhì)干細胞中的分子機制未見報道。因此，我們在鑒定出低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞環(huán)狀RNAs的基礎(chǔ)上[8]，用生物信息學手段分析預測環(huán)狀RNAs的結(jié)合miRNA及其靶基因，并對預測的靶基因進行GO分析和pathway富集分析；同時，根據(jù)pathway相互作用分析出核心pathway，為進一步實驗研究提供指引和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 circRNAs-miRNAs相互作用的生物信息學預測和網(wǎng)絡構(gòu)建

用基于TargetScan & miRanda的Arraystar公司的miRNA預測商業(yè)軟件進行circRNA和microRNA相互作用預測[9]，為每個circRNAs預測5個相互作用的miRNAs。用Cytoscape軟件繪制circRNAs-miRNAs可視網(wǎng)絡圖。

1.2 靶基因的生物信息學預測和網(wǎng)絡分析

分別用targetScan7.1和mirdbV5數(shù)據(jù)庫預測circRNAs高配備miRNAs的靶基因，在兩個數(shù)據(jù)庫中都預測存在的靶基因為真實可用的靶基因，并把靶基因分別在網(wǎng)站http://www.geneontology.org和http://www.genome.ad.jp/kegg上進行GO(Gene Ontology)功能富集分析和信號通路富集分析(KEGG pathway)。進行GO功能富集分析時采用Fisher精確檢驗法，算出P值后，通過多重比較，確定功能富集的假陽性率，然后只保留FDR≤0.1的數(shù)據(jù)，完成顯著性功能富集。信號通路富集分析是對靶基因參與的所有信號通路進行的顯著性分析，所用方法與GO功能富集分析相同。用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNAs-miRNAs-mRNA可視網(wǎng)絡圖。

1.3 網(wǎng)絡通路相互作用分析

在靶基因信號通路富集分析基礎(chǔ)上，根據(jù)信號通路涉及的靶基因數(shù)目和信號通路富集分析中的FDR值，用Cytoscape軟件構(gòu)建信號通路之間相互作用網(wǎng)絡圖，分析信號通路之間的相關(guān)關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞circRNAs對應的miRNAs預測和網(wǎng)絡構(gòu)建

按照堿基配備原則(圖1)，用Arraystar公司商業(yè)軟件為每個circRNAs配備了5個高配值的miRNAs。用Cytoscape軟件構(gòu)建circRNAs-miRNAs網(wǎng)絡圖(見圖2)。

圖1 circRNAs和對應miRNAs配備圖

圖2 circRNA-miRNA網(wǎng)絡圖

2.2 miRNAs靶基因的GO功能富集分析和網(wǎng)絡構(gòu)建

對預測的靶基因進行GO功能富集分析，檢測靶基因的功能。在GO分析的生物過程中，富集程度最高的GO terms 為“Developmental process”和“Nervous system development”, 其他的包括“Multicellular organism development”, “Cellular developmental process” 和“Positive regulation of cellular process”等為細胞生物過程相關(guān)的功能(表1)。提示這些生物學過程可能參與了低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞的生理過程。

表1circRNAs對應miRNA預測靶基因的GO生物學過程有差異的富集條目

2.3 靶基因的信號通路富集分析

用KEGG分析顯示富集4個有意義的信號通路分析(P<0.05 且 FDR<0.05) (表2),分別為“Transcriptional misregulation in cancer”、 “mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway”、“Adrenergic signaling in cardiomyocytes”和“Ubiquitin mediated proteolysis”。

2.4 網(wǎng)絡通路相互作用分析

根據(jù)信號通路涉及的靶基因數(shù)目和信號通路富集分析中的FDR值，用Cytoscape軟件構(gòu)建信號通路之間相互作用網(wǎng)絡圖，構(gòu)建通路相互作用網(wǎng)絡圖顯示MAPK通路為核心信號通路(見圖3)。

表2circRNAs對應miRNA靶基因的KEGG信號通路有差異的富集條目

圖3 信號通路相互作用網(wǎng)絡圖

3 討 論

氧對于幾乎所有的生命都是必需的，它維持細胞的能量代謝及功能。氧張力對細胞生物學行為的影響在一系列的影響因素中最為突出，且通過控制氧張力來影響細胞的生物學行為簡單易行[10]。20世紀90年代低氧誘導因子的發(fā)現(xiàn)使人們對低氧對機體的影響有了新的認識[11]。低氧對MSCs的生物學特性的影響及其在再生醫(yī)學中的應用是不可忽視的[6-7]。已有研究表明，低氧對MSCs的細胞周期、凋亡、遷移、增殖和分化均有影響。在氧體積分數(shù)小于5%時，低氧預處理可以作為在一定程度上克服MSCs的增殖緩慢、移植后遷移率低、基因不穩(wěn)定等細胞治療缺陷的有效手段，可以提高其臨床應用的有效性及安全性，對再生醫(yī)學的研究有至關(guān)重要的意義[12-13]。

競爭性內(nèi)源RNAs(pseudogene transcripts, lncRNAs, and circRNAs) 通過競爭結(jié)合miRNA反應元件調(diào)控基因表達的研究為生物醫(yī)學的熱點之一[14]。circRNAs的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，circRNAs作為miRNA的海綿吸附分子，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[15]。circRNAs參與間充質(zhì)干細胞生理過程的研究報道較少，僅報道雌激素受體β(ERβ)通過2:27713879/27755789/2:240822115/240867796-miR-328-5p-mRNA軸調(diào)控MSCs的成骨分化[16]。circRNAs及其相互作用的miRNAs在BMSCs成骨分化過程中起重要作用[17]。而miRNA對間充質(zhì)干細胞的影響研究報道較多，涉及到間充質(zhì)干細胞的細胞周期、增殖、分化和遷移等生理過程[18-19]。已有報道m(xù)iR-21在間充質(zhì)干細胞中強表達，通過調(diào)控BMPR2、SPRY1、TGFBR2和BMP促進間充質(zhì)干細胞成骨成脂分化，通過調(diào)控Sox2抑制細胞增殖，通過調(diào)控PDCD4、SPRY1、SPRY2和PTEN等增強細胞存活，保護細胞線粒體功能避免線粒體凋亡[20-21]。miR-27b通過調(diào)控SDF-1α的表達量，影響間充質(zhì)干細胞的遷移能力，通過靶向轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα抑制脂肪形成,通過調(diào)控APC、SATB2和手性鈣結(jié)合蛋白影響成骨分化[22-23]。

本研究中，用生物信息學技術(shù)分析低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞circRNA的靶結(jié)合位點，軟件預測circRNA的結(jié)合miRNA及其靶基因。GO分析表明細胞發(fā)育等是差異表達circRNAs的主要功能，hsa_circRNA_005232和hsa_circRNA_102700分別作用miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-373-5p，而hsa_circRNA_102854作用miR-21-3p。提示這些差異表達的circRNAs可能影響低氧預處理間充質(zhì)干細胞的增殖和分化等特性。信號通路富集分析顯示“Transcriptional misregulation in cancer”和“mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway”為最有意義的通路，提示這些circRNAs可能影響低氧預處理間充質(zhì)干細胞的基因組穩(wěn)定性和細胞特性。差異表達circRNAs的生物信息分析結(jié)果和已有報道的低氧預處理影響間充質(zhì)干細胞生物學特性研究結(jié)論相一致[6-7]。

本研究表明，MAPK通路為低氧預處理間充質(zhì)干細胞的核心通路，表明circRNAs通過該通路參與多種細胞功能相關(guān)，可參與細胞運動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程[24-25]。目前確定有4條MAPK信號轉(zhuǎn)導通路：extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway, c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway、p38 signaling pathway and ERK5 signaling pathway。在MAPK家族成員中。ERK、p38和JNK參與了hMSCs分化的信號轉(zhuǎn)導[26]。ERK-MAPK在細胞整個發(fā)育過程中均可激活，與細胞增殖和起始分化密切相關(guān)，而p38和JNK信號通路很可能是在細胞分化晚期或者凋亡階段發(fā)揮作用[24,27]。

本研究表明，低氧預處理人胎盤絨毛膜間充質(zhì)干細胞環(huán)狀RNAs同低氧預處理間充質(zhì)干細胞的生物學特性變化密切有關(guān)，為了解低氧預處理影響間充質(zhì)干細胞特性發(fā)生變化的分子機制提供新思路，為進一步實驗研究提供指引和理論依據(jù)。