高良姜黃酮類物質提取工藝的研究

程嘉怡，黃 和，2，曹湛慧，劉子聰

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學分析測試中心，廣東湛江 524088）

高良姜（Alpinia officinarum Hance） 屬姜科山姜屬多年生草本植物[1]，性辛、熱，具有溫胃止嘔、散寒止痛的功效[2]。近年來，高良姜已經隨著高良姜綜合開發利用的不斷深入，除藥用外，高良姜已經被應用到食品領域中[2]。研究表明，高良姜中某些活性成分具有抗菌、抗氧化等作用，特別是黃酮類物質表現出較好的抗菌活性[3]。因此，研究高良姜中黃酮類物質的提取，對高良姜進一步的開發利用及廣泛應用有至關重要的作用。

試驗采用索氏提取法、超聲波輔助提取2種方法，以黃酮類物質提取率為指標，對高良姜黃酮類物質的提取進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取高良姜根莖，清洗干凈，用小刀將外層皮去掉。用刀切片，置于數顯鼓風干燥箱中于50℃條件下烘干，再用高速粉碎機粉碎，過篩后于4℃冰箱保存，備用。

蘆丁，標準品，中國食品藥品檢定研究所提供；甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、95%乙醇、丙酮、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設備

BL-620S型電子天平，SHIMADZU公司產品；KQ-500DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；SIGMA3-18K型高速冷凍離心機，北京博勵行儀器有限公司產品；722S型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預處理

高良姜→清洗→烘干（50℃，48 h） →粉碎→過篩（50目） →冰箱保存（4℃）。

1.3.2 蘆丁對照品溶液的制備

準確稱取50.0 mg蘆丁標準品于250 mL容量瓶中，加入70%乙醇超聲溶解，定容至刻度，得質量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標準對照品溶液。

1.3.3 最佳測定波長的確定

精密移取蘆丁對照品溶液、樣品溶液、空白各2.0 mL置于25 mL比色管中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻；加入70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min[4]。于波長200～600 nm處掃描，確定最大吸收峰波長為505 nm。

1.3.4 蘆丁標準曲線的制作

精密吸取蘆丁對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL分別置于25 mL比色管中，依次加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液和乙醇溶液，步驟同1.3.3，于波長505 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標、蘆丁對照品溶液質量濃度為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線。

蘆丁對照品標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

由圖1可知，蘆丁對照品溶液在0.2～1.2 mg時與吸光度呈現良好的線性關系，所得回歸方程為Y=11.90X-0.005 9，相關系數R2=0.999 8，具有良好的線性關系。

1.3.5 樣品的測定

樣品中黃酮類物質含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）3比色法。

精確吸取樣品溶液2.0 mL，置于25 mL比色管中，步驟同1.3.3，于波長505 nm處測定吸光度。利用蘆丁標準曲線，計算樣品中黃酮類物質含量。

1.3.6 樣品中黃酮類物質提取率的計算

根據蘆丁標準曲線計算樣品中黃酮的質量濃度，通過下式計算提取率。

式中：C——根據標準曲線（Y=11.90X-0.005 9）計算出的樣品中黃酮類物質質量濃度，mg/mL；

V——樣品溶液體積，mL；

M——高良姜粉質量，g。

1.3.7 樣品中黃酮的定性

硝酸鋁反應：樣品提取液中加入2%硝酸鋁溶液，樣液顯色為黃色；鹽酸鎂粉反應：樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣液顯色為橙紅色；三氯化鐵反應：樣品提取液中加入數滴1%三氯化鐵溶液，樣液顯色為灰綠色。通過黃酮類化合物的特征顏色反應現象，確定提取物中含黃酮類化合物。

1.4 索氏提取法的工藝條件研究

1.4.1 單因素試驗

以高良姜為原料，稱取3.00 g/份，以乙醇為提取劑，使用索氏提取器進行提取。提取液紗布過濾，合并提取液，以轉速8 000 r/min離心10 min。將上清液合并，取一定體積稀釋。按1.3.5方法測定樣品中黃酮類物質含量。

（1）乙醇體積分數對提取效果的影響。試驗考查乙醇體積分數分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；固定提取溫度80℃，料液比1∶25，提取次數2次，提取時間1 h，考查不同乙醇體積分數對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（2）料液比對提取效果的影響。試驗考查料液比為 1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50；固定提取溫度80℃，乙醇體積分數60%，提取2次，每次提取時間1 h，考查料液比的差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（3）提取時間對提取效果的影響。試驗考查提取時間分別為1，2，3，4 h；固定提取溫度80℃，乙醇體積分數60%，料液比1∶25。考查提取時間差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（4）提取次數對提取效果的影響。試驗考查提取次數分別為1，2，3，4，5次；固定提取溫度80℃，乙醇體積分數60%，料液比1∶25，每次提取時間1 h，考查提取次數差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

1.4.2 正交試驗的設計

根據單因素試驗的結果，影響索氏提取法番石榴黃酮類物質提取的因素有乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取次數，為此設計四因素三水平正交試驗，以確定索氏提取法提取高良姜黃酮類物質的最佳工藝。

1.4.3 驗證試驗

依據正交試驗得出的最佳工藝條件，平行試驗3次，以驗證最佳工藝條件。

1.5 超聲波輔助提取法的工藝條件研究

1.5.1 單因素試驗

以高良姜為原料，稱取3.00 g/份，以乙醇為提取劑，一定時間范圍內超聲提取。紗布過濾提取液，濾液以轉速8 000 r/min離心10 min。將上清液合并，取一定體積稀釋。按1.3.5方法測定樣品中黃酮類物質含量。

（1）乙醇體積分數的選擇。試驗考查乙醇體積分數分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；固定料液比1∶20，超聲功率300 W，超聲時間30 min，考查乙醇體積分數的差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（2）料液比的選擇。試驗考查料液比分別為1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50；固定乙醇體積分數60%，超聲功率300 W，超聲時間30 min，考查料液比的差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（3）超聲時間的選擇。試驗考查超聲時間分別為 10，30，50，70，90 min；固定乙醇體積分數60%，料液比1∶20，超聲功率300 W，考查超聲時間差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

（4）超聲功率的選擇。試驗考查超聲功率分別為300，350，400，450，500 W；固定乙醇體積分數60%，料液比1∶20，超聲時間30 min，考查超聲功率的差異對提取效果的影響。平行試驗3次，測定黃酮類物質含量。

1.5.2 正交試驗的設計

根據單因素試驗的結果，選取影響超聲波輔助提取法提取番石榴黃酮類物質的主要因素為乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲功率，為此設計四因素三水平正交試驗，以確定超聲波輔助提取法提取高良姜黃酮類物質的最佳工藝。

1.5.3 驗證試驗

依據正交試驗得出的最佳工藝，平行試驗3次，以驗證最佳工藝。

2 結果與分析

2.1 索氏提取法的工藝研究

2.1.1 單因素試驗

（1）乙醇體積分數對提取率的影響。

乙醇體積分數對提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對提取率的影響

由圖2可知，高良姜的黃酮類物質提取率在乙醇體積分數為30%～70%處于明顯的不斷上升狀態；而當體積分數達70%時，提取率達到最大值；隨后提取劑體積分數上升，提取率反而下降。乙醇溶液可以作為提取劑提取黃酮類物質是因為相似相溶的原理，而過高體積分數的乙醇會促使某些醇溶性物質析出，從而對黃酮的提取造成了影響[5]，因此選擇體積分數70%的乙醇進行提取。

（2）料液比對提取率的影響。

料液比對提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可知，隨著高良姜和提取劑料液比的增大，高良姜黃酮類物質的提取率一開始增長比較迅猛。當料液比大于1∶35后，提取率開始下降。在物料一定的情況下，提取劑的增加加大了其與原料相互接觸的面積，使得反應更能充分進行。而過大的料液比則由于在反應已充分的情況下，沒有起到提高提取率的作用，同時造成了提取劑的浪費，加大成本。因此，最佳的料液比選擇應為1∶35。

（3）提取時間對提取率的影響。

提取時間對提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對提取率的影響

由圖4可知，當提取時間低于2 h時，由于在一定的時間內，反應時間的增加有利于黃酮類物質與有機溶劑反應，提取率增加；當提取時間高于2 h時，由于提取超過一定時間，其他化合物質的溶出會影響黃酮類物質提取率[3]，同時黃酮類物質因暴露時間過長而與空氣發生氧化[6]，大大降低提取效果，提取率顯著下降。因此，提取高良姜黃酮類物質的最佳時間應選擇為2 h。

（4）提取次數對提取率的影響。

提取次數對提取率的影響見圖5。

圖5 提取次數對提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數增加，提取率先增大后緩慢下降，同時提取次數的增加會造成提取劑的用量加大。因此提取次數應選為2次，提取率適宜的同時節約成本。

2.1.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取料液比、乙醇體積分數、提取時間、提取次數4個因素，各取3個水平，以黃酮類物質提取率為考查指標進行L9（34）的正交試驗。

索氏提取法正交試驗因素與水平設計見表1，索氏提取法正交試驗結果見表2。

表1 索氏提取法正交試驗因素與水平設計

表2 索氏提取法正交試驗結果

由表2可知，對高良姜黃酮類物質提取率影響因素的主次為A＞D＞B＞C，即料液比＞提取次數＞乙醇體積分數＞提取時間。索氏提取法提取高良姜黃酮類物質的最佳提取工藝為A1B3C2D3，即乙醇體積分數60%，料液比1∶40，提取次數3次，每次提取時間2 h。

按照最優組合條件為乙醇體積分數60%，料液比1∶40，提取次數3次，每次提取時間2 h進行驗證試驗，平行試驗3次。試驗結果穩定，高良姜黃酮類物質平均提取率達76.3 mg/g。

2.2 超聲波輔助提取法的工藝研究

2.2.1 單因素試驗

（1）乙醇體積分數對提取率的影響。

乙醇體積分數對提取率的影響見圖6。

圖6 乙醇體積分數對提取率的影響

由圖6可知，在乙醇體積分數為30%～60%時，提取率隨乙醇體積分數增加而增加；體積分數為60%時提取率達最大值；隨后提取劑體積分數上升，提取率急劇下降。與上述索氏提取法中提取劑體積分數對提取率的影響相似，高體積分數的乙醇促使醇溶性物質析出，因而對黃酮類物質的提取造成了影響。因此，選擇乙醇體積分數60%溶液為宜。

（2）料液比對提取率的影響。

料液比對提取率的影響見圖7。

圖7 料液比對提取率的影響

由圖7可知，在1∶50～1∶30時，隨著高良姜與提取劑料液比的增大，提取率顯著增加；料液比大于1∶30后，提取效果開始明顯降低。與上述索氏提取法中料液比對提取率的影響相似，過大的料液比沒有起到提高提取率的作用。因此，最佳的料液比選擇應為1∶30。

（3）超聲時間對提取率的影響。

超聲時間對提取率的影響見圖8。

由圖8可知，當超聲時間少于50 min時，提取率隨時間遞增；超聲時間為50 min時提取率最大；多于50 min后提取率顯著降低。這可能是由于隨著時間的增加，溶液溫度升高使反應溫度上升；而提取時間過長產生過強的熱效應會破壞提取物結構，使提取率下降。因此，超聲時間50min對于試驗的進行是較合適的。

（4）超聲功率對提取率的影響。

圖8 超聲時間對提取率的影響

超聲功率對提取率的影響見圖9。

圖9 超聲功率對提取率的影響

由圖9可知，黃酮類物質提取率隨超聲功率的增大而漸漸增大；當超聲功率達450 W時提取率最大；超聲功率大于450 W后，提取率逐漸下降。這是因為超聲功率不足時，穿透能力稍弱、物料溫度低、分子運動慢，進而影響物質的提取；而超聲功率加大后其對物質細胞壁的破壞程度增強，黃酮類物質大量溶出[7]；而當超聲功率超過一定限度時，高溫對黃酮類物質氧化和破壞的作用加大[8]，同時部分果膠物質溶出，從而影響測定結果，提取率降低。因此，提取高良姜黃酮類物質的超聲功率應選為450 W。

2.2.2 正交試驗的設計

根據單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲功率4個因素，以黃酮類物質提取率為考查指標進行L9（34）的正交試驗。

超聲波輔助提取法正交試驗因素水平見表3，超聲波輔助提取法正交試驗結果見表4。

表3 超聲波輔助提取法正交試驗因素水平

由表4可知，各因素水平對高良姜黃酮類物質提取率的作用大小為 B'＞C'＞A'＞D'，即料液比 ＞ 超聲時間＞乙醇體積分數＞超聲功率。超聲波輔助提取法提取高良姜中黃酮類物質的最佳工藝為A'1B'3C'3D'1，即乙醇體積分數50%，料液比1∶35，超聲時間70 min，超聲功率400 W。

按照最優組合進行驗證試驗，平行試驗3次。試驗結果穩定，高良姜黃酮類物質提取率達94.6 mg/g。

表4 超聲波輔助提取法正交試驗結果

2.3 2種提取方法的比較

采用索氏提取法和超聲波輔助提取法在最佳工藝下提取高良姜黃酮類物質，利用蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮含量，得到的提取率。

不同提取方法黃酮類物質提取率的比較見表5。

表5 不同提取方法黃酮類物質提取率的比較

由表5可知，采用超聲波輔助提取高良姜黃酮類物質，所得到的提取率比索氏提取法高，而且所需的提取時間較短。因此，超聲波輔助法更適用于高良姜黃酮類物質的提取。

2.4 黃酮類粗提物定性檢測

硝酸鋁反應：將樣品提取液中加入質量分數2%硝酸鋁溶液，樣品液顯示為黃色；鹽酸鎂粉反應：將樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣品液顯示為橙紅色；三氯化鐵反應：將樣品提取液中加入數滴質量分數1%三氯化鐵溶液，樣品液顯示為灰綠色。這都是黃酮類化合物的特征顏色反應現象，最終確定樣品溶液中含黃酮類化合物。

2.5 黃酮類粗提物和純化物的質量濃度計算

高良姜粉末經過提取、濃縮，分離純化后得到粗提物和純化物。利用蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮含量，測得黃酮類粗提物和純化物的質量濃度分別為0.624，0.861 mg/mL。

3 結論

分別采用索氏提取法和超聲波輔助法提取高良姜中黃酮類物質。通過單因素試驗和正交試驗，以提取率作為指標，索氏提取法最佳工藝為乙醇體積分數60%，料液比1∶40，提取次數3次，每次提取時間2 h，在此工藝條件下，高良姜黃酮類物質提取率為76.3 mg/g。超聲波輔助法最佳工藝為乙醇體積分數50%，料液比1∶35，超聲時間70 min，超聲功率400 W，超聲波輔助法提取的高良姜中黃酮類物質提取率為94.6 mg/g。

通過對比，超聲波輔助法的提取率較高，而且其所需提取時間較短、成本較低，較適用于高良姜中黃酮類物質黃酮物質的提取。高良姜粉末經過提取、濃縮，分離純化，得到粗提物和純化物。利用蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮含量，測得黃酮類粗提物和純化物的質量濃度分別為0.624，0.861 mg/mL。