組織培養條件下紫色松乳菇培養條件的優化

王 歡，欒竹青，劉傳林，龔雪琴，由翠榮，梁麗琨

（煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005）

菌根（Mycorrhiza） 是由真菌和植物根系形成的共生體[1]。侵染植物根系通過長期作用形成菌根的一類真菌稱為菌根性真菌。松乳菇（Laclarius deliciosus） 是一種很有開發價值的外生菌根真菌[2]，春、秋季單生或群生于針葉林下，常與松科植物共生形成外生菌根。外生菌根能加強植物對水分和礦質營養元素的吸收，并為植物提供多種植物激素、維生素、脂肪酸等代謝產物，促進植物生長[3-7]。松乳菇子實體含有較多粗脂肪、粗蛋白和人體必需氨基酸，質脆味美，藥食兩用，具有抗腫瘤和抗菌等功效，深受人們喜愛。但是由于松乳菇子實體發育特定共生關系等因素的影響，目前只能依賴于野生或半人工栽培，而不能人工規模種植，因此具有很大的研究空間[8-9]。為保護和合理開發利用這一珍貴食用菌資源，探索松乳菇的人工栽培技術具有重要意義。

目前，菌根性食用菌的半人工栽培技術逐漸成熟，該技術中如何提高菌根合成率和穩定性是研究重點[10-11]。利用組織培養技術可以在實驗室條件下迅速獲得大量松樹無菌苗，研究組織培養條件下松樹無菌苗與菌根性食用菌的共侵染能力和侵染條件，提高菌根合成能力，有望使松乳菇人工栽培成為可能。

植物組織培養的條件一般不利于菌根真菌的生長，因此研究組織培養條件下松乳菇的最適培養基及培養條件是共侵染及菌根合成研究的前提。

試驗以改良的1/2MS培養基為基本培養基[12]，采用單因素試驗研究組織培養條件下適合松乳菇菌絲生長的最適培養基及培養條件，為松乳菇與黑赤松無菌苗的侵染建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與培養基

1.1.1 菌種

采集于山東省煙臺市昆崳山的松乳菇子實體，經過組織分離并鑒定保存的純菌種。

1.1.2 基本培養基

1/2 MS離子[13]，200 g/L土豆，20 g/L葡萄糖，100 mg/L肌醇，100 mg/L酪蛋白，5.5 g/L瓊脂，pH值6.0。于115℃下滅菌30 min。

1.2 種子的制備

1.2.1 液體種子的制備

活化于固體基本培養基的菌種，無菌條件在菌落邊緣切取邊長約0.8 cm的菌絲塊8～10塊，接種于盛有80 mL基本液體培養基的250 mL錐形瓶中，靜置1 d，25℃下以轉速120 r/min遮光搖床培養，每隔3 d更換新鮮培養基。連續2次換液后選用直徑約2 mm的菌絲球作為液體種子。

1.2.2 固體菌種的制備

活化于固體基本培養基的菌種，無菌操作于菌落邊緣切取邊長約1.5 cm的菌絲塊，接種于固體基本培養基上，每瓶接種4塊，于25℃下遮光培養。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體培養基最適糖源的篩選

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養基中的葡萄糖，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下，以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測定菌絲球的干質量。

1.3.2 液體培養基最適糖源質量濃度的篩選

以5種糖類質量濃度（10，15，20，25，30 g/L）分別替換基本培養基中的葡萄糖質量濃度，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下，以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測定菌絲干質量。

1.3.3 液體培養基最適接種量的篩選

分別以接種量6%，8%，10%，12%，14%接種液體種子于液體基本培養基中，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下，以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測定菌絲干質量。

1.3.4 液體培養基最適裝液量的篩選

分別以5種裝液量70，75，80，85，90 mL將基本培養基分別裝于250 mL的錐形瓶中，以10%的接種量接種液體種子，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下，以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測定菌絲干質量。

1.3.5 最適液體培養條件下生長曲線的測定

以最適接種量接種液體種子于優化的液體培養基中，于25℃下，以轉速120 r/min搖床遮光培養16 d，每天取3瓶測定菌絲干質量，以培養時間為橫坐標，菌絲干質量為縱坐標繪制曲線。

1.3.6 固體培養基最適糖源的篩選

分別用20 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養基中的葡萄糖，用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種固體基本培養基，每瓶接種1塊，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下遮光培養14 d，采用垂直交叉法測量菌落直徑，并觀察菌絲生長情況。

1.3.7 固體培養基最適糖源質量濃度的篩選

分別以質量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養基中的葡萄糖質量濃度，用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種固體基本培養基，每瓶接種1塊，每組處理5個平行，3次重復試驗。于25℃下遮光培養14 d，采用垂直交叉法測量菌落直徑，并觀察菌絲生長情況。

1.3.8 最適固體培養條件下生長曲線的測定

用無菌打孔器切取固體種子的邊緣位置接種優化的固體培養基，每瓶接種1塊，于25℃下遮光培養16 d。每天測量菌落直徑，以培養時間為橫坐標、菌落直徑日增長量為縱坐標繪制曲線。

2 結果與分析

2.1 糖源種類對松乳菇液體培養的影響

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養基中的葡萄糖，于25℃下以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測量菌絲干質量。

使用不同糖源松乳菇液體培養的菌絲干質量見圖1。

圖1 使用不同糖源松乳菇液體培養的菌絲干質量

從圖1可看出，在其他條件相同的情況下，紫色松乳菇對5種糖類都可利用，但利用程度不同。在含葡萄糖的培養基中，菌絲生長旺盛、菌絲球潔白，菌絲干質量達0.68 g，約為其他糖類的2倍，因此葡萄糖最適合松乳菇液體培養。其次是麥芽糖，菌絲球密度較大、生長良好；可溶性淀粉不易分解難以直接利用，且易產生沉淀；紫色松乳菇利用率最低的是乳糖，菌絲球密度較低、菌絲干質量僅0.27 g。

周國英等人[14]對松乳菇菌絲深層液體培養營養因子及培養條件的研究表明，最適碳源為葡萄糖，硫酸鎂和氯化鈉可以加速啟動生長，磷酸二氫鉀使菌絲產量提高。周傳云等人[15]對松乳菇液態培養工藝及其飲料配方的研究表明，最佳培養基配方各添加量為麩皮汁4%，葡萄糖4%，蔗糖3%，馬鈴薯汁25%，米糠汁5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.15%。

2.2 糖源質量濃度對松乳菇液體培養影響

分別用質量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養基中葡萄糖，于25℃下以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測量菌絲干質量。

不同糖源質量濃度松乳菇液體培養的菌絲干質量見圖2。

圖2 不同糖源質量濃度松乳菇液體培養的菌絲干質量

由圖2可知，不同糖源質量濃度對松乳菇液體培養菌絲生物量有影響。糖源質量濃度過低不能滿足菌絲生長的需求造成菌絲生長緩慢；而糖源質量濃度過高則會導致培養液黏稠度增大、降低溶解氧濃度，不利菌絲生長。在以葡萄糖為糖源的培養基中，松乳菇菌絲生物量隨著葡萄糖質量濃度的增加呈先增后降的趨勢，在25 g/L時達到最大值。

2.3 松乳菇液體培養的最適接種量

分別以6%，8%，10%，12%，14%接種量接種液體種子于液體基本培養基中，25℃下以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測量菌絲干質量。

不同接種量松乳菇液體培養的菌絲干質量見圖3。

圖3 不同接種量松乳菇液體培養的菌絲干質量

適宜的接種量可使菌種利用營養物質快速生長，獲得大量的菌絲球。接種量過低，菌絲生長緩慢，在生長周期內無法獲得期望的生物量；接種量過高，定量的營養物質無法滿足菌絲的生長要求，菌絲產生的代謝廢物大量積累，也會對菌絲的生長造成威脅。從圖3可看出，接種量為12%時，菌絲干質量達到最大值。

2.4 松乳菇液體培養基的最適裝液量

分別用70，75，80，85，90 mL替換基本培養基中的裝液量，于25℃下以轉速120 r/min搖床遮光培養14 d，測量菌絲干質量。

不同裝液量松乳菇液體培養的菌絲干質量見圖4。

圖4 不同裝液量松乳菇液體培養的菌絲干質量

裝液量對菌絲的生長有一定影響。裝液量過少，每次獲得的菌絲生物量也少，并且隨著培養天數的增加，培養液易變黏稠；裝液量過多，無法滿足菌絲生長所需要的供氧量，不利于菌絲的生長。從圖4可看出，隨著裝液量的增加，菌絲干質量也在增加，在裝液量為90 mL時達到最大值。

2.5 松乳菇在最適液體培養條件下的生長

以12%的接種量接種液體種子于優化的液體培養基中，以培養時間為橫坐標，菌絲干質量為縱坐標繪制曲線。

松乳菇在最適液體培養條件下的生長曲線見圖5。

圖5 松乳菇在最適液體培養條件下的生長曲線

從圖5可看出，松乳菇液體種子接種到優化的液體培養基后，先開始一段延滯期，這一時期菌絲適應新生長環境，合成生長所需要的各種酶或輔酶等；從5 d開始進入快速生長期，這一時期，營養物質充足、代謝旺盛、外部環境穩定、菌絲生長量達最大值；之后進入穩定期，菌絲干質量趨于穩定，這一時期一般4 d左右；穩定期過后進入衰亡期，因為外部環境的變化和代謝廢物的積累造成菌體老化、自溶，菌絲球由白色變為黃色、菌絲生物量下降、培養液變渾濁。

2.6 糖源種類對松乳菇固體培養影響

分別用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉和乳糖替換基本培養基中的葡萄糖，25℃下遮光培養14 d，測量菌落直徑。

糖源種類對松乳菇固體培養的影響見圖6，不同糖源對松乳菇菌絲生長的影響見圖7。

圖6 糖源種類對松乳菇固體培養的影響

圖7 不同糖源對松乳菇菌絲生長的影響

不同種類糖源對松乳菇固體培養的菌絲生長存在顯著影響。從圖6可看出，在以葡萄糖為糖源的培養基中菌落直徑最大，生長速度最快；其次是蔗糖和麥芽糖；菌落直徑最小的糖源為乳糖。從圖7可看出，在葡萄糖為糖源的培養基中菌絲最為濃密、菌絲生長快速呈白色；其次是可溶性淀粉和麥芽糖，菌絲生長較濃密，部分呈黃色；在含蔗糖和乳糖的培養基中菌絲生長稀疏。

李忠海等人[16]對松乳菇固體培養的研究表明，松乳菇菌絲生長的最適培養基是PDA培養，無光照培養。杜麗飛等人[17]對松乳菇菌種分離及菌絲生長特性的研究表明，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為乙酸銨，其次是玉米漿和蛋白胨。

2.7 糖源質量濃度對松乳菇固體培養的影響

分別用質量濃度10，15，20，25，30 g/L替換基本培養基中的葡萄糖，測量菌落直徑。

不同糖源質量濃度對松乳菇絲生長的影響見圖8，不同糖源質量濃度對松乳菇菌絲生長的影響見圖9。

從圖8可看出，在一定濃度范圍內的糖源質量濃度對菌絲的生長有促進作用，但質量濃度過高或過低都會抑制菌絲生長。在質量濃度25 g/L葡萄糖的培養基中，菌絲生長速度最快，菌落直徑最大。

從圖9可看出，在糖源質量濃度為25 g/L時，菌絲最為濃密，活力旺盛呈白色；其次為20 g/L和15 g/L，菌絲較密，菌落中部呈黃色出現老化現象。

2.8 松乳菇固體培養的生長曲線

圖8 不同糖源質量濃度對松乳菇絲生長的影響

圖9 不同糖源質量濃度對松乳菇菌絲生長的影響

接種固體種子于優化的固體培養基上，每天測量菌落直徑，以培養時間為橫坐標、菌落直徑日增長量為縱坐標繪制曲線。

松乳菇在最適固體培養條件下的生長曲線見圖10。

圖10 松乳菇在最適固體培養條件下的生長曲線

從松乳菇固體培養的生長曲線可看出，將生長良好菌絲活力旺盛的固體種子接入優化的培養基中，首先需要適應新生長環境，菌絲生長緩慢；從6 d開始進入快速生長期，這一時期約維持2 d，8 d菌落直徑日增長量達最大值；之后，菌絲增長速度開始下降，菌絲開始褐化衰老。