氧化苦參堿下調(diào)ZNF580以抑制LTC-14細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的分子機(jī)制研究

陳凱，張青，劉百慶，陳偉，周芳，張?zhí)m，夏時海，許威

胰腺纖維化（pancreatic fibrosis，PF）是胰腺組織逐漸被纖維成分所取代，導(dǎo)致進(jìn)行性胰腺內(nèi)外分泌功能不全［1］。PF的發(fā)生、發(fā)展是慢性胰腺炎（chronic pancreatic，CP）和胰腺癌（pancreatic cancer，PC）的主要病理特征。作為PF 的中心環(huán)節(jié)，胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSC）的活化越來越受到重視。激活的PSC可以產(chǎn)生包括Ⅰ型膠原在內(nèi)的大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分［2］，從而促進(jìn)PF 的進(jìn)展。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）作為重要的致纖維化細(xì)胞因子在PSC的持續(xù)激活中扮演著重要角色，其經(jīng)典下游通路Smads 通路的激活是其發(fā)揮作用的主要途徑［3］。研究表明，Smad2和鋅指轉(zhuǎn)錄因子580（zinc finger transcription factor 580，ZNF580）相互結(jié)合，共同作用于TGF-β1 信號通路［4］。ZNF580作為一種鋅指蛋白基因，在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮作用。ZNF580 的激活及蛋白的表達(dá)會導(dǎo)致下游的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）表達(dá)變化，而MMP-2 可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減輕組織纖維化［5］。然而，ZNF580 在胰腺纖維化中的作用還有待于研究。

氧化苦參堿（oxymatrine，OM）是從中藥苦參中提取的一種中藥單體，其抗氧化［6］、抗纖維化［7］作用已被證實。筆者前期研究證實，OM 可以抑制胰腺星狀細(xì)胞激活，減輕胰腺纖維化［8］，但其分子靶點(diǎn)尚不明確，具體機(jī)制尚未完全闡明。因此，本實驗旨在探究ZNF580 在OM 抗胰腺纖維化過程中的作用及其分子機(jī)制，為OM 的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 胰腺星狀細(xì)胞LTC-14 細(xì)胞株由德國Rostock 大學(xué)醫(yī)院的Robert Jaster 教 授惠贈［9］。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶消化液購自美國Gibco 公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；ShRNA-ZNF580 質(zhì)粒購自上海吉瑪基因有限公司；XtremeGENE HP 轉(zhuǎn)染試劑購自美國羅氏公司；Trizol 購自美國Thermo Fisher公司；Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自南京建成生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR 試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ZNF580 抗體購自美國Abcam 公司；MMP-2、Smad2、Smad3、GAPDH 抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1）抗體、ECL 發(fā)光液購自沈陽萬類生物科技有限公司；PVDF 膜購自美國BD 公司；OM、DMSO購自美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；引物購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) LTC-14 細(xì)胞使用10%FBS 的IMDM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的孵育箱（相對濕度為95%）中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按干預(yù)方式的不同接種于6孔板中，達(dá)到70%～80%接觸密度時進(jìn)行處理，每組3 個平行孔。對照組：正常培養(yǎng)的LTC-14 細(xì)胞；TGF-β1 組：LTC-14 細(xì)胞中加入10μg/L TGF-β1刺激12 h；TGF-β1+OM組：1 g/L OM 預(yù)處理LTC-14細(xì)胞30 min，然后加入10μg/L TGF-β1刺激12 h；TGF-β1+SiZNF850 組：LTC-14 細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染ShRNAZNF580 質(zhì)粒，24 h 后加入10μg/L TGF-β1 刺激12 h。各組培養(yǎng)完后分別收集培養(yǎng)基和細(xì)胞。

1.2.2 ZNF580 基因表達(dá)抑制 取對數(shù)生長期LTC-14 細(xì)胞經(jīng)消化、離心、重懸，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將含有約5×105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液接種到6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時棄培養(yǎng)基，更換無血清IMDM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后按照說明書轉(zhuǎn)染ShRNAZNF580質(zhì)粒，使ZNF580基因低表達(dá)。

1.2.3 Real-time PCR 檢測細(xì)胞基因表達(dá) 將各組收集的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后每孔直接加入1 mL Trizol，提取總RNA，一步法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后使用SYBR Green 染料法進(jìn)行Realtime PCR，按說明書步驟檢測ZNF580、Smad2、Smad3、MMP-2、TIMP1 基因表達(dá)，根據(jù)qPCR 得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計結(jié)果，ΔCt=目的基因Ct 值－內(nèi)參Ct 值，ΔΔCt=實驗組ΔCt 值－對照組ΔCt 值。實驗結(jié)果以對照組的倍數(shù)表示。引物設(shè)計經(jīng)由PubMed 下引物合成程序Primer-BLAST設(shè)計，見表1。

Tab.1 Sequence of each gene primer表1 各基因引物序列

1.2.4 Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 將各組收集的細(xì)胞用PBS 清洗后，加入100μL 蛋白裂解液，經(jīng)細(xì)胞破碎儀超聲后，置于冰上30 min，充分裂解，13 000 r/min 離心20 min，提取總蛋白，BCA 蛋白定量后變性。按每孔30μg 蛋白濃度上樣，90～120 V 電泳1.5 h，90 V 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗ZNF580（1∶1 000）、Smad2（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、MMP-2（1∶500）、TIMP1（1∶200）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫?fù)u床孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光，Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，所得結(jié)果用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 ELISA法檢測細(xì)胞外基質(zhì)中Col-I、Col-III、FN、TNF-α和IL-1β 的分泌水平 取細(xì)胞上清液，預(yù)先封閉酶標(biāo)板，確定稀釋濃度，按1孔陰性對照，8孔標(biāo)準(zhǔn)品（2倍稀釋），各組3復(fù)孔待測樣品上樣，按說明書依次加入酶標(biāo)抗體、底物液、終止液37 ℃孵育，并在每一個步驟后洗板，酶標(biāo)儀測定各組樣品450 nm處的吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對換算為濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 6.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OM 和ZNF580 基因沉默對MMP-2/TIMP1 比值的影響 與對照相比，TGF-β1 組MMP-2/TIMP1 比值在mRNA 和蛋白水平上均降低（P＜0.05）；而TGF-β1+OM 組和TGF-β1+SiZNF580 組中MMP-2/TIMP1 比值均顯著高于TGF-β1 組（P＜0.05），見圖1、表2。

Fig.1 The influence of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1圖1 OM和ZNF580基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中MMP-2/TIMP1比值的影響

Tab.2 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表2 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中MMP-2/TIMP1表達(dá)的影響 （n=3，±s）

Tab.2 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP-2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表2 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中MMP-2/TIMP1表達(dá)的影響 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與TGF-β1 組比較，P＜0.05；表3～6同

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+OM組TGF-β1+SiZNF850組F MMP-2/TIMP1 mRNA水平1.37±0.54 0.39±0.04a 3.15±0.37b 3.29±0.82b 21.629＊＊MMP-2/TIMP1蛋白水平3.10±1.22 1.43±0.30a 6.98±1.80b 5.96±1.05b 13.219＊＊

2.2 OM 和ZNF580 基因沉默對ECM 分泌水平的影響 與對照組相比，TGF-β1組中Col-I、Col-III、FN、TNF-α和IL-1β水平均升高（P＜0.05）；而TGF-β1+OM 組和TGF-β1+SiZNF580 組中上述ECM 各指標(biāo)分泌水平均顯著低于TGF-β1組（P＜0.05），見表3。

2.3 OM和ZNF580基因沉默對TGF-β1/Smads信號通路的影響 與對照組相比，TGF-β1 組中Smad2、Smad3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 組 和TGF-β1+SiZNF580 組 中Smad2、Smad3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平較TGF-β1組均下降（P＜0.05），見圖2、表4。

2.4 OM和ZNF580基因沉默對LTC-14細(xì)胞活化的影響 和對照組相比，TGF-β1 組中α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 組和TGF-β1+SiZNF580 組中α-SMA的mRNA 和蛋白表達(dá)水平較TGF-β1組均顯著下降（P＜0.05），見圖3、表5。

Tab.3 The effect of OM and SiZNF580 on the secretion level of ECM in LTC-14 cells induced by TGF-β1表3 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中ECM分泌水平的影響 （n=3，ng/L，±s）

Tab.3 The effect of OM and SiZNF580 on the secretion level of ECM in LTC-14 cells induced by TGF-β1表3 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中ECM分泌水平的影響 （n=3，ng/L，±s）

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+OM組TGF-β1+SiZNF580組F Col-Ⅰ6.20±0.55 14.13±1.33a 8.14±0.71b 7.14±0.14b 58.934＊＊Col-Ⅲ5.07±1.15 16.65±2.42a 7.02±1.13b 5.95±0.43b 40.125＊＊FN 23.53±2.63 50.88±4.77a 29.82±1.33b 26.91±1.85b 52.358＊＊TNF-α 7.82±0.72 18.97±1.79a 10.90±0.50b 9.67±0.91b 60.547＊＊IL-1β 4.54±1.02 12.44±2.61a 7.03±0.55b 5.11±0.76b 17.839＊＊

Fig.2 The influence of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1圖2 OM和ZNF580基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中Smad2、Smad3基因表達(dá)的影響

Tab.4 The effect of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表4 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中Smad2、Smad3表達(dá)水平的影響（n=3，±s）

Tab.4 The effect of OM and SiZNF580 on the expressions of Smad2 and Smad3 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表4 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中Smad2、Smad3表達(dá)水平的影響（n=3，±s）

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+OM組TGF-β1+SiZNF580組F mRNA水平Smad2 1.10±0.15 2.07±0.25a 1.09±0.11b 1.04±0.07b 28.206＊＊Smad3 1.02±0.05 3.85±1.06a 1.42±0.41b 1.04±0.06b 17.140＊＊蛋白水平Smad2 0.55±0.08 1.04±0.17a 0.60±0.03b 0.58±0.06b 16.736＊＊Smad3 0.48±0.18 1.68±0.34a 0.49±0.12b 0.45±0.06b 26.417＊＊

2.5 OM 下 調(diào)LTC-14 細(xì) 胞 中TGF-β1 誘 導(dǎo) 的ZNF580 基因的表達(dá) TGF-β1 組ZNF580 mRNA 和蛋白水平較對照組顯著升高（P＜0.05），而TGF-β1+OM 組和TGF-β1+SiZNF580 組中ZNF580 表達(dá)較TGF-β1組均顯著降低（P＜0.05），見圖4、表6。

3 討論

Fig.3 The influence of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1圖3 OM和ZNF580基因沉默對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的影響

Tab.5 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1表5 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中α-SMA表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

Tab.5 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of α-SMA in LTC-14 cells induced by TGF-β1表5 OM和SiZNF580對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中α-SMA表達(dá)水平的影響 （n=3，±s）

組別對照組TGF-β1組TGF-β1+OM組TGF-β1+SiZNF850組F α-SMA mRNA水平1.04±0.04 3.81±0.26a 1.19±0.14b 0.99±0.06b 244.252＊＊α-SMA蛋白水平0.58±0.05 1.82±0.15a 0.69±0.07b 0.52±0.09b 122.804＊＊

Fig.4 OM represses the expression of ZNF580 in LTC-14 cells induced by TGF-β1圖4 OM下調(diào)LTC-14細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的ZNF580基因的表達(dá)

胰腺纖維化是慢性胰腺炎和胰腺癌的共同病理特征，是胰腺功能喪失［10］和胰腺癌細(xì)胞對放化療藥物不敏感［11］的主要原因。由于胰腺纖維化的分子機(jī)制尚未闡明，迄今為止，臨床上仍缺乏對慢性胰腺炎和胰腺癌有效的藥物或治療方式［1］，因此研究胰腺纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制顯得尤為重要。

PSC 在胰腺纖維化中的作用越來越受到重視［12］。在正常情況下，PSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，其代謝和功能不活躍，無促纖維化作用；當(dāng)胰腺組織受損或炎癥因子等因素刺激時，PSC活化，細(xì)胞代謝及增殖活躍，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、LN、FN 等ECM 分泌增多，且MMP-2/TIMP1比值下降，致使ECM分泌增多而降解減少，最終形成胰腺纖維化［13］。PSC 在胰腺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起到核心作用［14］。近年來，PSC的生物學(xué)功能研究主要集中在生物學(xué)特性與ECM 的相互作用等方面。研究發(fā)現(xiàn)，PSC 與ECM 之間相互影響，阻斷它們之間的相互作用可能是抑制進(jìn)行性胰腺纖維化的有效措施［15］。

Tab.6 The effect of OM and SiZNF580 on the expression of MMP2/TIMP1 in LTC-14 cells induced by TGF-β1表6 OM對TGF-β1誘導(dǎo)的LTC-14細(xì)胞中ZNF580表達(dá)的影響 （n=3，±s）

?

TGF-β1是誘導(dǎo)PSC激活的主要細(xì)胞因子，在胰腺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其主要通過TGF-β1/Smads 通路激活PSC［16］，下調(diào)MMPs/TIMPs比值，促進(jìn)ECM 分泌，誘導(dǎo)胰腺纖維化［17］。本研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可上調(diào)LTC-14 細(xì)胞中Smad2、Smad3 和α-SMA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，且下調(diào)MMP2/TIMP1的比值，致使細(xì)胞分泌的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α 和IL-1β 水平升高，表明TGF-β1 通過Smads 通路激活LTC-14 細(xì)胞，從而使LTC-14 細(xì)胞ECM分泌水平升高。

大量研究發(fā)現(xiàn)，OM 可通過TGF-β1 減輕肝［18］、腎［19］、心肌［20］等器官的纖維化。筆者前期研究表明，OM 可以抑制LTC-14 細(xì)胞中TGF-β1/Smads 通路的激活［21］，下調(diào)α-SMA 的表達(dá)［8］。本研究也發(fā)現(xiàn)，OM 可以抑制LTC-14 細(xì)胞中TGF-β1 對Smad2、Smad3和α-SMA 的上調(diào)作用。而進(jìn)一步研究顯示，OM 可抑制LTC-14 細(xì)胞中TGF-β1 對MMPs/TIMPs比值的下調(diào)，進(jìn)而抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α和IL-1β 的分泌，表明OM 通過阻抑TGF-β1/Smads信號通路抑制LTC-14 細(xì)胞激活，減少ECM 分泌。因此，Smads 蛋白在OM 抗TGF-β1 所致的胰腺纖維化中發(fā)揮重要作用，研究Smad信號通路下游的關(guān)鍵分子將有助于闡明胰腺纖維化發(fā)生的分子機(jī)制以及OM的作用機(jī)制。

Luo 等［4，22］運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)和共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，Smad2 和ZNF580 相互結(jié)合，共同作用于TGF-β1信號通路，且TGF-β1下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ZNF580 的表達(dá)水平。而本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可上調(diào)LTC-14 細(xì)胞中ZNF580 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。TGF-β1對ZNF580基因截然相反的調(diào)節(jié)作用，可能與細(xì)胞種類有關(guān)，ZNF580在不同細(xì)胞中發(fā)揮作用可能不同，但其深入機(jī)制還有待于研究。值得注意的是，ZNF580 基因沉默后，TGF-β1 對LTC-14 細(xì)胞中Smad2、Smad3 和α-SMA 基因的上調(diào)作用也被阻滯，且TGF-β1對MMP2/TIMP1比值的下調(diào)作用被抑制，PSC 分泌的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN、TNF-α 和IL-1β 水平也下調(diào)。這些結(jié)果表明，ZNF580 基因沉默可抑制Smads通路的活化，進(jìn)而抑制LTC-14細(xì)胞激活，減少ECM 分泌，提示ZNF580 和Smads 通路之間可能存在調(diào)控機(jī)制。另外，本研究顯示OM 可以抑制LTC-14細(xì)胞中TGF-β1對ZNF580基因的上調(diào)作用。結(jié)合上述結(jié)果，筆者推測OM可能通過TGF-β1/Smads/ZNF580通路抑制PSC的活化，進(jìn)而減少ECM的分泌，減輕胰腺星狀細(xì)胞纖維化。

綜上所述，OM 可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路來下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子ZNF580 的表達(dá)，抑制LTC-14 的活化，阻滯LTC-14 細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN等ECM 的分泌，并上調(diào)MMP-2/TIMP1 比值，減輕胰腺纖維化。ZNF580 可能是OM 的作用靶點(diǎn)，在胰腺纖維化中發(fā)揮重要作用，但具體的分子機(jī)制仍需深入研究。