苯乙雙胍通過影響線粒體功能促進A549/DDP細胞凋亡

侯永旺，常嬌，王艷輝，任麗

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］。早期肺癌多行手術聯合化療的方案，但對于晚期肺癌患者，化療是其主要的治療方式。化療的藥物種類繁多，但以鉑類為主的化療方案最為主要。然而，有部分肺癌患者對于鉑類藥物的治療反應性很差，即出現順鉑耐藥現象，尤其是非小細胞肺癌。苯乙雙胍是通常用于治療2型糖尿病的一種雙胍類藥物［2］，因其在治療2型糖尿病過程中出現的不良反應，所以在部分國家限制了該藥的使用［3］。然而有研究表明，苯乙雙胍具有抗腫瘤活性［4］，并且與2-脫氧葡萄糖（2-DG）聯合使用可以降低乳酸中毒的發生率［5］。另外，苯乙雙胍可以干擾肝癌細胞的線粒體的氧化磷酸化功能，從而達到抑制腫瘤的作用［6］。但是苯乙雙胍抗腫瘤的作用機制尚不明確，本研究旨在探討苯乙雙胍對肺癌細胞的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP 和A549 細胞源自于天津醫科大學免疫微環境與疾病省部共建教育部重點實驗室。主要試劑：DCFH-DA 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑、Mitotracker Red 線粒體示蹤劑和Rhod-2 鈣離子檢測試劑均購自美國Invitrogen 公司，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）Annexin V 凋亡試劑盒購自美國BD 公司，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒購自中國碧云天試劑公司，總DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，RPMI-1640培養基購自美國Gibco 公司，抗氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）抗體混合物購自美國Abcam公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購自美國BI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549/DDP 細胞和A549 細胞分別培養于含10%小牛血清的1640的培基中，放于5%CO2、37 ℃細胞培養箱中培養，隔天換液1 次，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞活力測定 將對數生長期的A549 細胞和A549/DDP細胞分別接種于96孔板，每孔5 000個細胞，貼壁24 h后分別加入50μmol/L 順鉑和2.5 mmol/L 苯乙雙胍處理，每組設置5 個復孔，分別檢測0、24、48 h 的細胞活力。每孔加入20μL MTS，37 ℃反應1 h，酶標儀檢測490 nm 處光密度（OD）值，計算細胞增殖率R1（%）=OD（終時點）/OD（0h）×100%，實驗重復3次。

1.2.3 增殖實驗及克隆形成實驗 取對數生長期的A549/DDP細胞，實驗分為2組，苯乙雙胍組以2.5 mmol/L苯乙雙胍處理，對照組采用PBS 處理。（1）細胞增殖實驗：將對數生長期的A549/DDP細胞接種于96孔板，每孔5 000個細胞，每組設置5 個復孔，貼壁24 h 后，開始對A549/DDP 細胞分組處理，之后每孔加入20μL MTS，37 ℃反應1 h，在490 nm 處分別檢測2組不同處理的細胞第0 h、24 h、48 h的OD值。計算細胞增殖率R2（%）=OD（終時點）/OD（0h）×100%，實驗重復3 次。（2）克隆形成實驗：將對數生長期的A549/DDP 細胞，調整密度為10 000個/mL，按照312個/孔細胞梯度接種于6孔板，貼壁24 h 后，對A549/DDP 細胞分組處理，實驗組每隔2 d 換上含有苯乙雙胍的新鮮培養基；對照組每隔2 d 換上新鮮培養基，待克隆形成后結晶紫染色，統計2組集落形成的個數，實驗重復3次。

1.2.4 凋亡實驗 分組及處理同1.2.3，細胞處理24 h 后，用胰蛋白酶將細胞消化，收集于干凈的離心管中，PBS 洗3 遍，調整細胞密度為1×106/mL，加入FITC Annexin V 和PI 染料，避光孵育5～10 min后，上流式細胞儀進行檢測，統計凋亡率，凋亡率=Q2區數值+Q3區數值，實驗重復3次。

1.2.5 胞內ROS、線粒體質量和線粒體鈣離子檢測 分組及處理同1.2.3，細胞處理24 h后，棄去原培養基，加入無血清的培養基后，分別加入終濃度為10μmol/L DCFH-DA 2 mL 避光反應10 min檢測細胞內ROS、100 nmol/L Mitotracker Red 2 mL反應15 min檢測線粒體質量、4μmol/L Rhod-2 2 mL染色10 min檢測鈣離子，染色結束后，消化離心，PBS洗3遍，調整細胞密度為1×106/mL，用濾網將細胞過濾后，上流式細胞儀進行檢測，計算每組細胞熒光強度（fluorescence intensity，FI）。

1.2.6 ATP 檢測 分組及處理同1.2.3，細胞處理24 h 后，棄去培養基，置于冰上，PBS洗3遍，加入200μL裂解液裂解細胞。按照ATP 檢測試劑盒內的實驗步驟進行檢測，用luminometer 檢測RLU 值，實驗結果以與對照組的倍數表示，實驗重復3次。

1.2.7 mtDNA檢測 分組同1.2.3。用總DNA提取試劑盒提取A549/DDP細胞的總DNA，通過實時熒光定量PCR檢測2組的mtDNA 表 達 量。 引 物 序 列：Mt -Mito 上 游 5′-CACTTTCCACACAGACATCA-3′， 下 游 5′ - TGGTTA GGCTGGTGTTAGGG - 3′；B2M 上 游 5′- TGTTCCT GCTGGGTAGCTCT-3′，下游5′-CCTCCATGATGCTGCTTACA-3′。PCR反應體系：DNA模板200 ng，2μL；引物混合物1μmol/L，8μL；SYBER Green 10μL。反應條件：預變性95 ℃5 min，1個循環；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共45個循環；熔解曲線分析：95 ℃10 s，65 ℃60 s，97 ℃1 s，1個循環；冷卻：37 ℃30 s，1個循環。根據qPCR得出的熒光曲線的Ct值，以B2M基因為內參，ΔCt=目的基因Ct值-B2M基因Ct值，ΔΔCt=實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值，用2-ΔΔCt計算結果。實驗重復3次。

1.2.8 Western blot 檢測線粒體氧化磷酸化蛋白表達 PBS和2.5 mmol/L 苯乙雙胍處理A549/DDP 細胞24 h，棄去培養基，PBS 洗3 遍，每孔加入200μL 含蛋白酶抑制劑的RIPA 細胞裂解液，在冰上用細胞刮將細胞刮下，置于冰上30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清，用BCA 蛋白定量試劑盒檢測對照組和實驗組蛋白濃度。每組上樣20μg 蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，60 V 電壓40 min 使蛋白進入分離膠，100 V電壓電泳1 h。100 V電壓4 ℃濕轉80 min將膠上蛋白轉至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF 膜1 h，4 ℃搖床孵育抗OXPHOS（混合抗體，1∶500稀釋）過夜。TBST洗膜3次，室溫孵育二抗（1∶10 000稀釋）1 h，TBST洗膜3次，使用Immobilon Western 化學發光HRP 底物和Tanon 6200 發光成像儀器檢測蛋白的表達水平，以ATP5A 為內參，計算各組蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用GraPh Pad Prism 7.0 和FlowJo 7.6 作圖，SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用±s表示，2組比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 順鉑和苯乙雙胍對A549/DDP 細胞和A549 細胞增殖率的影響 （1）組間比較。與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP 細胞在24 h 和48 h 的細胞增殖率降低（P＜0.05），而2組間A549細胞24 h和48 h增殖率差異無統計學意義。（2）組內不同細胞系間比較。48 h 順鉑處理的A549/DDP 細胞增殖率均高于A549 細胞（P＜0.05），而24 h 間差異無統計學意義；苯乙雙胍處理的A549/DDP 細胞增殖率24 h 和48 h均低于A549細胞（P＜0.05），見表1。

2.2 苯乙雙胍對A549/DDP 細胞生長的影響 與PBS組相比較，苯乙雙胍組A549/DDP細胞的24 h和48 h 增殖率、集落形成數減低，而凋亡率升高（P＜0.05），見表2、圖1。

Fig.1 Effects of different treatments on colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells圖1 不同處理對A549/DDP細胞克隆形成個數和凋亡率的影響

2.3 苯乙雙胍對A549/DDP 細胞線粒體功能的影響 與PBS組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP細胞內ROS 水平增高，Mitotracker、Rhod-2、mtDNA 及ATP水平降低（P＜0.05），見圖2、表3。Western blot 結果顯示，用苯乙雙胍組的A549/DDP細胞線粒體氧化磷酸化復合物Ⅰ中的NDUFB8、復合物Ⅱ中的SDHB和復合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表達量明顯降低（P＜0.05），見圖3、表4。

3 討論

順鉑是臨床上治療肺癌的主要化療藥物，但是隨著順鉑耐藥的出現，使得順鉑的使用和療效在一定程度上受到了限制。苯乙雙胍是治療糖尿病的雙胍類藥物，能夠促進多種癌細胞死亡，但是苯乙雙胍在A549/DDP細胞中的作用機制尚鮮見報道，本研究結果顯示，與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP 細胞在24 h的細胞活力比降低，而2組間A549細胞24 h活力差異無統計學意義。為了排除因為藥物作用時間所導致的不穩定性，本研究檢測了2 組藥物作用48 h 對兩種細胞活力的影響，結果發現與順鉑組比較，苯乙雙胍組A549/DDP細胞在48 h的細胞活力比降低，而2組間A549細胞48 h活力差異無統計學意義，用順鉑處理的兩種細胞在24 h 細胞活力差異無統計學意義，這也許是因為藥物作用時間短所導致。但是在48 h，順鉑處理的A549/DDP細胞活力比A549 細胞活力高；而苯乙雙胍處理的A549/DDP 細胞活力低于A549細胞，表明A549/DDP細胞較A549細胞對苯乙雙胍更為敏感。

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2種藥物對不同細胞增殖率的影響 （n=3，%，±s）

Tab.1 Effects of two drugs on the proliferation rate of different cells表1 2種藥物對不同細胞增殖率的影響 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05；t1、t2表示2組內不同細胞系間24 h、48 h比較

組別順鉑組苯乙雙胍組t A549/DDP細胞24 h48 h24 h48 h 83.113±7.59765.683±10.24065.516±12.39644.386±30.363±5.03317.877±5.29248.550±5.03333.790±10.026＊7.184＊2.1961.90 A549細胞8.139 5.132 7 t1 t2 2.096 4.425＊2.820＊3.739＊

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙雙胍對A549/DDP細胞的增殖率、集落形成數、凋亡率的影響 （n=3，±s）

Tab.2 Effects of phenformin on proliferation rate,colony number and apoptosis rate of A549/DDP cells表2 苯乙雙胍對A549/DDP細胞的增殖率、集落形成數、凋亡率的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05

組別PBS組苯乙雙胍組t增殖率（%）24 h 267.840±42.246 33.949±8.430 9.404＊48 h 512.438±44.416 19.210±7.024 18.998＊集落形成數（個/視野）158.000±37.041 3.333±1.528 7.226＊凋亡率（%）6.987±2.405 33.950±4.727 8.805＊

Fig.2 Effects of phenformin on ROS,Mitotracker and Rhod-2 in A549/DDP cells圖2 苯乙雙胍對A549/DDP細胞內ROS，Mitotracker和Rhod-2的影響

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙雙胍對A549/DDP細胞線粒體功能的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of phenformin on mitochondrial function of A549/DDP cells表3 苯乙雙胍對A549/DDP細胞線粒體功能的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05；表中ROS，Mitotracker，Rhod-2的數據是熒光強度值（FI），mtDNA和ATP的值是標準化以后的倍數值

組別ROS Mitotracker Rhod-2mtDNA ATP PBS組苯乙雙胍組t 2 042 333±354 367 3 103 333±544 548 2.829＊471 000±110 436 251 333±42 063 3.220＊20 133±5 390 5 744±868 4.565＊1.000 0±0.000 0 0.720 4±0.116 3 4.165＊1.000 0±0.000 0 0.558 3±0.077 0 9.934＊

Fig.3 Western blot detection of OXPHOS protein expression in two groups圖3 Western blot檢測2組OXPHOS蛋白的表達

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相對表達量（n=3，±s）

Tab.4 Relative expression of OXPHOS protein表4 OXPHOS蛋白相對表達量（n=3，±s）

＊P＜0.05

組別PBS組苯乙雙胍組t MTCO1 1.000 0±0.000 0 0.476 7±0.155 4 5.835＊SDHB 1.000 0±0.000 0 0.263 3±0.070 2 18.166＊NDUFB8 1.000 0±0.000 0 0.356 7±0.102 6 10.857＊

Yanjun等［7］研究發現苯乙雙胍能夠抑制膀胱癌細胞增殖和克隆形成，促進膀胱癌細胞凋亡，Wang等［8］研究發現，苯乙雙胍可以抑制肺癌細胞增殖。本研究結果發現，與PBS 組相比較，苯乙雙胍組A549/DDP細胞的24 h和48 h增殖率、集落形成數減低，而凋亡率升高，表明苯乙雙胍能夠明顯抑制A549/DDP 細胞增殖、克隆形成并促進其凋亡，提示苯乙雙胍可能是治療耐順鉑肺癌的潛在藥物。研究表明，苯乙雙胍在LKB-1缺失肺癌中具有抗腫瘤活性［9］，在細胞代謝應激狀態下，LKB-1 是激活AMPK的主要激酶，而AMPK 是一種高度保守的能量傳感器和細胞生長和代謝調節劑，苯乙雙胍通過LKB-1/AMPK 通路發揮抑制腫瘤細胞增殖作用，可抑制AMPK 磷酸化，降低其對于苯乙雙胍的作用［10］。Matsuzaki 等［11］發現苯乙雙胍可抑制線粒體氧化磷酸化復合體Ⅰ的活性，從而達到促進細胞凋亡的效果。線粒體是真核細胞重要的細胞器，其在細胞能量代謝、生物合成和細胞死亡的調控中起關鍵作用，參與了腫瘤細胞活性氧自由基穩態變化、組織浸潤和轉移能力以及抵抗細胞死亡［12］。線粒體對于清除ROS有重要作用，線粒體功能破壞后膜電位受損，會導致細胞內ROS 聚集，誘導細胞凋亡［13］。本研究結果表明，與PBS 組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP 細胞內ROS 水平增高，Mitotracker、鈣離子水平減低，表明在A549/DDP細胞內線粒體膜電位減低，這可導致ROS堆積。這些結果與Liu等［14］發現的線粒體膜電位受損可導致ROS 增多，從而導致細胞死亡結果相似。因此，筆者推測苯乙雙胍促進A549/DDP細胞凋亡可能是通過破壞線粒體膜電位、增加胞內ROS這一機制發揮作用。

癌細胞存活需要大量ATP來滿足其自身增殖過程中生物合成所需的能量，而線粒體的主要功能之一就是通過氧化磷酸化產生ATP。Goscinski等［15］研究發現，mtDNA減少、MTCO1表達蛋白降低、ATP水平降低會促進前列腺癌細胞死亡。本研究結果顯示，與PBS 組相比，苯乙雙胍組的A549/DDP 細胞內mtDNA 及ATP 水平降低，線粒體氧化磷酸化復合物Ⅰ中的NDUFB8、復合物Ⅱ中的SDHB和復合物Ⅳ中的MTCO1 蛋白表達量明顯降低，與Goscinski 等［15］和Kang 等［16］結果相似。目前研究普遍認為苯乙雙胍可以抑制線粒體氧化磷酸化復合物Ⅰ，而本結果顯示苯乙雙胍還同時抑制了A549/DDP 細胞線粒體氧化磷酸化復合物Ⅱ和復合物Ⅳ，這也許是細胞系不同導致的差異，還需要進一步研究和驗證。因此，苯乙雙胍能夠減少mtDNA，抑制氧化磷酸化，從而導致ATP 生成減低，這也許是苯乙雙胍抑制A549/DDP細胞增殖的另一種可能的機制。