木蘭花堿減輕慢性應激小鼠抑郁樣行為及對腦部LSD1組蛋白修飾的影響

曹冰雁，劉藝潔，武莉莉，費喬曼，楊冰，張玲，喬衛△

酸棗仁（Zizyphi Spinosae Semen，ZSS），又稱作棗仁、酸棗核，為鼠李科植物酸棗的干燥種子，多用于治療驚悸多夢、盜汗、虛煩不眠等癥。木蘭花堿，又名木蘭堿，在酸棗仁中含量較高［1］，但關于其抗抑郁作用的報道較少［2］。表觀遺傳是指在不改變核苷酸序列的前提下，通過對染色體等的可逆性修飾來改變基因的表達。可逆性修飾包括DNA修飾、RNA沉默以及組蛋白修飾等方面［3］。其中組蛋白修飾常在相關酶的催化作用下，進行甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等修飾［3］。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）是第一個被發現的組蛋白特異性去甲基化的酶。LSD1 與神經細胞增殖、情緒表現、學習記憶等有關［4］。本研究采用慢性不可預見性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）進行實驗造模，觀察木蘭花堿對抑郁小鼠行為學的影響，并在基因與蛋白水平檢測LSD1含量的變化。

1 材料與方法

1.1 一般材料 （1）實驗動物。健康雄性ICR小鼠，SPF級，體質量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（津）2005-0001。動物飼養溫度為24～28 ℃，自然晝夜節律光照，適應7 d 后進行實驗。（2）儀器。Centrifuge 5810R 離心機（德國Eppendorf 公司）；TBE-1000A高速逆流色譜儀（上海同田技術有限公司）；Nano Drop?2000c（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；雙反應模塊梯度PCR儀（美國Bio-rad 公司）；7500 Real-time PCR System（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；蛋白電泳槽（美國Bio-rad 公司）；多功能成像分析系統（英國UVItec分子生物成像系統）。（3）藥品及試劑。酸棗仁購自安徽亳州市藥都國草堂藥材店，經天津醫科大學藥學院周曄教授鑒定為酸棗Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chou 干燥成熟的種子。本實驗室經提取分離得到酸棗仁中木蘭花堿（＞95%）；石油醚、乙醇、正丁醇、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純（天津基準化學試劑有限公司）；TRIzol?（美國Invitrogen 公司）；SYBR Green Master Mix 實時定量PCR 試劑盒（瑞士Roche 公司）；Revert AidTMReverse Transcription Kit 反轉錄試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；兔源LSD1 單克隆抗體（英國Abcam 公司）；鼠源β-肌動蛋白單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 二抗（美國Cell Signaling Technology公司）；ECL化學發光液（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 健康雄性ICR小鼠共40只，按照體質量編號，采用抽簽法將小鼠隨機分為4 組，即正常對照組（control 組）、抑郁模型組（PG 組）、木蘭花堿高劑量組（MH組）和木蘭花堿低劑量組（ML組），每組10只。根據小鼠體質量進行灌胃給藥，MH 組給予藥17.3 mg/（kg·d），ML 組給予藥7 mg/（kg·d），control 組、PG 組給予等量蒸餾水。于每日8:00—9:00灌胃1次。采用21 d慢性不可預見性溫和刺激構建小鼠抑郁模型，除control 組外，其余組小鼠在21 d 內隨機安排10 種應激因素，每天給予任意2 種刺激，為避免小鼠產生適應性，平均每種刺激給予4次。刺激方式包括潮濕飼養12 h、無墊料飼養12 h、冷水游泳（25 ℃）6 min、傾斜12 h、晝夜顛倒、夾尾1 min、熱水游泳（45 ℃）6 min、睡眠剝奪12 h、禁食12 h、禁水12 h［5］。

1.2.2 懸尾實驗（tail suspension test，TST） 將小鼠尾尖端1/3處固定在懸尾箱內，使動物呈懸空倒掛狀，懸掛兩側用隔板擋住小鼠視線。動物為克服不正常體位而掙扎活動，但當感覺無望后，停止掙扎。實驗共進行6 min，記錄后4 min 內的不動時間。

1.2.3 強迫游泳實驗（forced swimming test，FST） 將小鼠單獨放在盛有溫水的深10 cm、直徑18 cm透明玻璃缸中，水溫25 ℃。小鼠入水后會掙扎試圖逃跑但又無法逃脫，感覺無望后，僅將頭露出水面四肢呈不動狀態，實驗進行6 min，記錄后4 min內小鼠的不動時間。

1.2.4 小鼠腦組織總RNA 的提取以及逆轉錄 取小鼠腦組織，加入TRIzol?試劑，按照說明書提取總RNA。用Nano Drop?2000c 測定RNA 濃度。加入相應的引物，使用Revert AidTMReverse Transcription Kit反轉錄試劑盒進行逆轉錄。

1.2.5 實時熒光定量PCR 按照SYBR Green Master Mix說明書進行操作，PCR反應體系為：SYBR Green Master Mix 10μL、上下游引物（10μmol/L）各0.2μL、cDNA 1μL、H2O 8.6μL。PCR引物序列如下：β-actin上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，下游5′-AATGTCACGCACGATTTCCC-3′；LSD1上游5′-CGACTTCCCCATGACCGAAT-3′ ， 下 游 5′- GAGTGGCTTCAAACGTCAGC-3′。反應條件為：95 ℃5 min；95 ℃15 s，60 ℃40 s，40個循環。采用2-ΔΔCt方法處理數據。

1.2.6 Western blot 法檢測LSD1 的表達情況 將腦組織研碎，加入含蛋白酶抑制劑（Phenyl methane sulfonyl Fluoride，PMSF）的RIPA 裂解液提取總蛋白，之后測定蛋白濃度。根據各組所測蛋白濃度，加入4×SDS 上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，-20 ℃保存。將蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，采用濕轉的方法將蛋白轉移至PVDF 膜上，使用5%的脫脂奶粉進行封閉，分別加入兔源LSD1（1∶5 000）、鼠源β-肌動蛋白單克隆抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，漂洗3次，每次10 min。加入相應的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，ECL化學發光液顯色。用image J軟件進行灰度分析。

1.2.7 免疫組化法檢測LSD1 的表達情況 斷頭取腦組織，浸泡于10%福爾馬林溶液中固定，常規脫水、浸蠟，制成石蠟切片。切片脫蠟、水化后，抗原修復4 次，每次6 min；放置室溫后，3%H2O2去離子水室溫避光封閉10 min；山羊血清封閉15 min；滴加LSD1 抗體（1∶200），4 ℃過夜。滴加反應增強液、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 聚合物，室溫20 min；DAB 顯色，蘇木精復染2 min，鹽酸乙醇分化10 min；梯度脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察，拍照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件對以上數據進行處理，計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 木蘭花堿對抑郁小鼠不動時間的影響 與control 組相比較，PG 組小鼠的TST、FST 累計不動時間均延長（P＜0.05）。與PG組相比較，MH組、ML組小鼠的累計不動時間均縮短，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木蘭花堿對小鼠不動時間的影響 （n=10，±s）

Tab.1 Effects of magnoflorine on immobility time of mice表1 木蘭花堿對小鼠不動時間的影響 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與PG組比較，P＜0.05

組別control組PG組MH組ML組F TST累計不動時間（s）54.59±22.97 92.10±19.59a 60.71±14.75b 70.60±17.05b 7.574＊＊FST累計不動時間（s）79.10±45.02 123.20±34.05a 59.50±25.44b 75.70±46.71b 4.985＊＊

2.2 木蘭花堿對腦部LSD1 表達的影響 在mRNA水平，與control組相比，PG組LSD1表達差異無統計學意義，ML 組LSD1 表達明顯升高（P＜0.05）；與PG組相比，ML組LSD1表達明顯升高（P＜0.05）。在蛋白水平，與control組相比，PG組LSD1表達明顯降低（P＜0.05），ML 組LSD1 表達明顯升高（P＜0.05）；與PG 組相比，ML 組LSD1 明顯升高（P＜0.05），見表2、圖1。

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1表達的影響（n=3，±s）

Tab.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1 of brain in three groups of mice表2 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1表達的影響（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與PG組比較，P＜0.05

組別control組PG組ML組F mRNA表達1.00±0.03 0.84±0.26 1.36±0.10ab 7.971＊蛋白表達0.47±0.02 0.37±0.01a 0.71±0.02ab 302.332＊＊

Fig.1 Effect of magnoflorine on the expression of LSD1 in brain of mice圖1 木蘭花堿對小鼠腦部LSD1蛋白表達的影響

2.3 小鼠腦部LSD1 免疫組化染色結果 PG 組LSD1 呈低表達，control 組、ML 組LSD1 蛋白表達陽性細胞數明顯增多，見圖2。

Fig.2 Effects of magnoflorine on the expression of LSD1（immunohistochemistry staining,×400）圖2 木蘭花堿對LSD1表達的影響（免疫組化染色，×400）

3 討論

本研究采用CUMS 法建立小鼠抑郁模型，引起小鼠行為學、神經免疫以及內分泌等方面的改變，模擬出人類抑郁癥的形成，與人類抑郁癥癥狀相似［6］。酸棗仁具有鎮靜催眠、抗抑郁、抗焦慮等多種藥理活性［7-8］。已有研究證實，酸棗仁總生物堿具有顯著的抗抑郁作用，可降低腦部單胺氧化酶的含量［9］，其中異喹啉型成分木蘭花堿的含量最高。據報道，異喹啉類生物堿在抗抑郁治療上有較好的應用前景［10］。現有藥理研究表明，木蘭花堿具有抗氧化、抗心律失常、降壓等藥理作用［11-12］，但在抗抑郁方面報道較少，因此本研究以木蘭花堿作為研究對象，評價其潛在的抗抑郁作用。

抑郁小鼠行為學實驗結果顯示，木蘭花堿能顯著改善CUMS小鼠的抑郁行為，而木蘭花堿高、低劑量組對于改善小鼠抑郁樣行為未見明顯差異。因此，本研究選擇木蘭花堿低劑量組進行后續的分子生物學實驗。本實驗室前期研究確認，酸棗仁發揮抗抑郁作用最佳組分配伍配比為黃酮與生物堿部位1∶12～1∶14［13］。本實驗中以藥典規定的酸棗仁每日用量12 g為依據，先折算成小鼠劑量后，根據2種最佳組分中木蘭花堿的含量計算出給藥高低劑量。本實驗中木蘭花堿服用劑量低于藥代動力學文獻報道的劑量［14］，對正常小鼠未見明顯不良反應。

表觀遺傳學的修飾與調控研究逐漸成為生命科學的熱點，研究大多圍繞著腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病以及神經疾病開展。組蛋白修飾是表觀遺傳學研究中的一項重要內容，主要包括乙酰化與甲基化研究。研究表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑對于神經疾病的治療具有較大的潛力［15］。目前組蛋白去甲基化酶研究大多圍繞著腫瘤［16］、心肌梗死［17］、炎癥［18］等進行，而對神經疾病治療的報道較少。由于組蛋白去甲基化酶LSD1 與單胺氧化酶具有緊密的同源關系，為單胺氧化酶家族的成員［19］，而單胺氧化酶抑制劑是目前臨床常用的抗抑郁類藥物，已有研究探索以LSD1 抑制劑治療抑郁癥［20-21］。本研究結果顯示，抑郁小鼠腦部的LSD1 含量降低，經木蘭花堿治療后，在基因和蛋白水平上LSD1 的表達均升高，這與研究報道相反［20-21］。因此，在治療抑郁癥方面，主要是通過升高還是降低LSD1 表達仍未明確，需進一步深入研究。

綜上所述，慢性應激造模后，抑郁小鼠在TST及FST 行為學上不動時間延長，且LSD1 基因、蛋白的表達水平均下降。通過木蘭花堿治療后減輕了其抑郁樣行為，同時也提高了LSD1 的表達。說明木蘭花堿具有一定的抗抑郁效果，并且木蘭花堿可能是通過LSD1靶點發揮其抗抑郁治療作用。