川芎嗪通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導自噬改善糖尿病腎病大鼠腎損害

鐘娟，陳靜，青姚，吳曙粵，鐘慶榮△

糖尿病腎?。―N）是糖尿?。―M）全身微血管病變的腎臟表現，也是DM 最常見且最影響其預后的慢性并發癥。由DN所致的終末期腎臟疾?。‥SRD）患者5年生存率低于20%，其已成為全球范圍內ESRD 最主要的死亡原因，嚴重威脅著人類的健康［1］。DN 的發病機制十分復雜，迄今尚未完全明了，且缺乏有效的治療藥物。川芎嗪（Ligustrazine，TMP）是從中藥傘形科植物川芎提取的總生物堿中分離的四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine），具有抗氧化、改善微循環、降血糖、抑制糖化產物的形成等藥理作用［2］，臨床上用于心、腦、腎及血管疾病等的治療。筆者的前期研究已證實，TMP 可以通過降低血糖、改善血液黏度以及抑制醛糖還原酶活性從而改善DN 大鼠腎損傷［3］。本研究擬從PI3K/Akt/mTOR信號通路和自噬角度進一步探討TMP對DN大鼠腎臟保護的作用機制，為DN的防治提供進一步的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠108 只，體質量180～220 g，動物許可證號：SCXK 粵2006-0015，購自南方醫科大學實驗動物中心。所有大鼠均飼養于南方醫科大學SPF級實驗動物中心層流架內，置于空氣流通，溫度22～25 ℃，濕度40%～70%的環境中，給予12 h 光照，普通飼料喂養，自由進食及飲水。

1.1.2 藥物與試劑 川芎嗪片購自北京市燕京制藥廠（50 mg/片，批準文號：國藥準字H11021964，生產批號160106）；厄貝沙坦片購自杭州賽諾菲制藥有限公司（150 mg/片，國藥準字J20080061，生產批號5A173）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司），兔源一抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、pmTOR、LC3B購自美國CST公司；鼠源一抗β-actin 以及HRP標記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；尿微量白蛋白及尿肌酐檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 垂直電泳儀（美國Bio-RAD公司）；羅氏血糖儀（北京怡成生物電子技術有限公司）；microplate reader 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；日立7180 全自動生化儀（深圳市永利鑫科技有限公司）；倒置顯微鏡XD101 型（南京江南光電股份有限公司）；Kodak Image Station 2000MM 成像系統（美國KODAK公司）。

1.2 方法

1.2.1 DN大鼠動物模型建立 所有大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表隨機選取其中12只作為正常對照組，其余大鼠禁食12 h后，采用STZ腹腔注射，并予高糖高脂飼料喂養，具體造模方法和成模標準參考文獻［3］。造模過程中死亡率約為16%。

1.2.2 動物分組及藥物干預 模型大鼠隨機分為模型組，TMP 低、中、高劑量組，厄貝沙坦組；另加正常組，共6 組（n=12）。TMP 分別按50、100、200 mg/（kg·d）灌服，厄貝沙坦予50 mg/（kg·d）灌服，模型組和正常組大鼠灌服等量生理鹽水，1次/d，療程為8周。

1.2.3 尿微量白蛋白與尿肌酐比值（UACR）檢測 各組在藥物干預前和干預后均進行UACR 檢測，測量前禁食＞8 h，采集尿液標本，尿液標本采用酶法測定尿肌酐，免疫比濁法測定尿微量白蛋白，計算UACR。UACR以尿微量白蛋白（g）/尿肌酐（mol）表示。

1.2.4 腎臟病理檢查 在最后1 次給藥后，禁食12 h，稱質量，以0.3%戊巴比妥鈉按35 mg/kg腹腔注射麻醉，摘取腎臟，去除腎外層包膜，取厚度約4 mm腎組織，4%甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，再分別予蘇木素-伊紅（HE）和過碘酸-雪夫（PAS）染色，光鏡下進行觀察、拍照。

1.2.5 Western blot 檢測PI3K/Akt/mTOR 信號通路及自噬標志蛋白LC3B 的表達 取凍存的腎組織，稱質量后在研缽內用液氮迅速將組織研磨成粉末，將研磨的組織粉末轉移到EP 管中。每50 mg 腎組織加入400μL RIPA 裂解液（含4μL磷酸酶抑制劑、4μL蛋白酶抑制劑），按蛋白提取試劑盒說明書提取組織總蛋白，采用BCA 蛋白定量法測各組蛋白濃度。Western blot 實驗方法參考文獻［4］，以β-actin 為內參，運用Image Station 2000R圖像工作站取像，進行條帶灰度分析。

1.2.6 免疫組化檢測各組腎組織LC3B的表達 各組腎組織標本經4%甲醛固定后自來水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后浸蠟和包埋，切取2μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水洗后，現配3%H2O2，室溫孵育20 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗3 次后，取兔抗LC3B一抗工作液（1∶100）50μL覆蓋組織片，置濕盒中蓋上蓋防蒸發，室溫孵育60 min；PBS 漂洗3 次，滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS 漂洗3次后，配制DBA 顯色劑，室溫孵育5 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加蘇木素液約2滴至組織片上，5 min后流水沖洗干凈，再滴加0.5%鹽酸乙醇1 滴，約10 s 后自來水沖洗。中性樹膠封片，光鏡下觀察。每組取6張切片標本，以出現清晰的淺黃色/棕褐色顆粒判定為陽性，采用Image Pro Plus 6.0（IPP）軟件對目的蛋白的著色進行半定量分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0 統計軟件進行統計學處理，數據采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用Tukey 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMP 對DN 大鼠UACR 的影響 經藥物干預前，模型組、厄貝沙坦組以及TMP 低、中、高劑量組與正常組相比，UACR 均顯著升高（P＜0.05），但模型組與TMP 低、中、高劑量組及厄貝沙坦組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。經藥物治療8 周后，模型組大鼠UACR 與正常組相比顯著升高（P＜0.01），各給藥組UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低劑量組與模型組比較差異無統計學意義，而TMP 中、高劑量組UACR 顯著低于模型組（P＜0.05），且TMP 中、高劑量組與厄貝沙坦組之間差異無統計學意義（P＞0.05），提示中劑量TMP的治療已能減緩DN大鼠UACR的升高，見表1。

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪對DN大鼠UACR的影響 （n=12，g/mol，±s）

Tab.1 Effects of ligustrazine on UACR in DN rats表1 川芎嗪對DN大鼠UACR的影響 （n=12，g/mol，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與厄貝沙坦組比較，P＜0.05

組別正常組模型組川芎嗪低劑量組川芎嗪中劑量組川芎嗪高劑量組厄貝沙坦組F治療前120.50±33.53 196.25±66.43a 199.94±71.41a 202.73±64.77a 198.37±68.02a 196.03±73.18a 2.973＊治療后131.04±53.58 350.32±96.50a 304.33±89.36ac 250.40±80.10ab 241.57±83.21ab 239.65±84.72ab 9.647＊＊

2.2 TMP 改善DN 大鼠腎臟病理的改變 DN 大鼠腎臟外觀腫脹、質地變硬，經HE 染色后光鏡下觀察模型組大鼠腎組織可見大量的蛋白管型，腎小管上皮細胞脫落及空泡變性，炎性細胞廣泛浸潤于腎間質；PAS染色可見大量糖原沉積于腎小管和腎小球，腎小球系膜區擴大、細胞外基質顯著增多。但經藥物干預后，中劑量TMP 組與模型組相比，腎小管損傷明顯減輕，腎小球系膜區基質增生顯著減少，見圖1、2。

2.3 TMP 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路及自噬標志蛋白LC3B表達的影響 結果顯示，模型組大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達與正常組相比顯著增加（P＜0.05）；而自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值與正常組相比明顯降低（P＜0.05）。但經TMP 干預后，DN 大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、pmTOR 表達顯著減少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯升高，其中TMP 中、高劑量組與模型組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），但TMP 中、高劑量組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 免疫組化檢測TMP 對DN 大鼠腎組織LC3B 表達的影響 模型組大鼠腎組織LC3B 表達量與正常組大鼠相比顯著減少（P＜0.05），而經中劑量TMP干預后，DN 大鼠腎組織LC3B 表達與模型組相比顯著增多（P＜0.05），與厄貝沙坦組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、5。

3 討論

DN是由于長期慢性高血糖導致的腎臟損害，臨床上以蛋白尿和進展性腎功能不全為特征，是全球范圍內導致ESRD 的首要原因，嚴重威脅患者生命健康。自噬是細胞應對應激情況而出現的一種非損傷性應答反應，通過對自身胞質內細胞器和（或）物質進行包裹及吞噬，從而形成自噬小體，其進一步與細胞溶酶體融合，發展為自噬溶酶體，降解包裹及吞噬物。通過細胞的自噬，降解的產物可以重新供給細胞利用或者排泄出細胞，因此自噬對穩定細胞的結構、功能以及代謝平衡有著重要的意義。參與自噬調節的信號通路復雜，其中以PI3K/Akt/mTOR 信號通路最為典型［4-5］。

Fig.1 HE staining of renal tissues in four groups of rats(×200)圖1 各組大鼠腎組織蘇木素-伊紅（HE）染色情況（×200）

Fig.2 PAS staining of renal tissues in four groups of rats(×200)圖2 各組大鼠腎組織過碘酸-雪夫（PAS）染色情況（×200）

Fig.3 Effects of ligustrazine on PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and protein expression of LC3B圖3 川芎嗪對PI3K/Akt/mTOR信號通路及自噬標志蛋白LC3B表達的影響

Fig.4 Immunohistochemical staining of LC3B in renal tissues of rats(×200)圖4 免疫組化檢測TMP對DN大鼠腎組織LC3B表達的影響（×200）

Fig.5 Quantitative analysis of LC3B detected by immunohistochemistry staining圖5 LC3B免疫組化陽性表達的定量分析

DM 時機體處于高血糖、高胰島素血癥、氧化應激、炎癥反應等應激狀態，通過自噬的調節可以增強機體的防御能力并減輕這些應激所致的損傷，進而延緩DM 及其并發癥的發生與進展。研究發現，DN狀態下，腎臟PI3K/Akt/mTOR信號通路被異常激活，自噬受到抑制，從而引起腎臟系膜細胞增殖、胞外基質積聚，導致腎臟損傷、腎小球肥大［6］。此外，Lu等［7］研究報道PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活可加速DN大鼠腎纖維化的發生與惡化。因此，自噬的改變與DN的發病機制密切相關，開發具有調控自噬作用的藥物可能是預防或治療DN的新靶點。

TMP是提取自活血化瘀中藥川芎的一種生物堿成分，具有拮抗脂質過氧化、清除自由基、抗炎、抗微生物、改善血流動力學、抑制糖化產物的形成以及調節免疫功能等生物學活性作用，大量臨床報道顯示TMP治療DN有著顯著的療效［8-9］。韓嬌艷等［10］和劉中祿等［11］研究還發現，TMP 可以通過抑制PI3K/Akt和mTOR 介導的信號通路，從而降低前列腺癌PC3細胞增殖并促進其凋亡，進而發揮抗腫瘤效應。并且，潘盼盼等［6］基于以上信號通路，觀察黃芪甲苷聯合TMP 對DM 大鼠的腎臟保護作用及其機制，證實TMP 可以通過抑制Akt/mTOR 信號通路，降低固醇調節元件結合蛋白-1（SREBP-1）表達，從而改善DM 大鼠血糖、24 h 尿蛋白排泄、腎功能及腎臟病理改變，進而對DM大鼠腎臟具有保護作用。此外，文獻報道TMP 還可以通過激活核因子E2 相關因子2（Nrf2）和抑制核轉錄因子κB（NF-κB），減輕DM 引起的腎損害［12］。本課題組前期研究也證實，TMP 可以通過降低血糖、改善血液黏度和抑制醛糖還原酶活性降低DN大鼠血尿素氮和肌酐水平、升高肌酐清除率［3］，但其具體作用的分子機制尚有待進一步探究。

本研究擬從PI3K/Akt/mTOR信號通路和自噬角度探討TMP 對DN 大鼠腎臟保護的作用機制。并且，本研究根據美國腎臟病基金會的倡議和國內最近研究進展［13-14］，采用UACR 替代傳統的24 h 尿蛋白定量檢查。而厄貝沙坦減少蛋白尿和保護腎功能的作用已得到國際公認［15］，故作為陽性對照藥。研究發現，DN 大鼠與正常組大鼠相比，UACR 顯著升高，經8周干預后，各給藥組UACR 均有不同程度的降低，但TMP 低劑量組與模型組比較未見顯著差異，而TMP 中、高劑量組UACR 顯著低于模型組，且TMP 中、高劑量組與厄貝沙坦組間比較未見顯著差異，提示中劑量TMP的治療已能減緩DN大鼠UACR的升高。同時我們也發現，經中劑量TMP 干預后，HE和PAS染色均顯示DN大鼠腎臟病理改變明顯減輕。而且Western blot 檢測模型組大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 的表達與正常對照組相比顯著增加，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值較正常對照組明顯降低。但經TMP干預后，DN大鼠腎組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 表達顯著減少，而LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值明顯升高，其中TMP 中、高劑量組與模型組相比差異均有統計學意義，但TMP 中、高劑量組之間比較未見顯著差異。此外，免疫組化進一步證實中劑量TMP的治療顯著增加DN大鼠腎組織自噬標志蛋白LC3B的表達。上述實驗結果說明，TMP可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，從而促進腎臟自噬，進而減輕系膜細胞增殖和胞外基質積聚、改善DN大鼠腎臟病理改變，降低UACR，減緩DN的發生與進展；而其有效劑量可以考慮為100 mg/（kg·d）。

綜上所述，TMP 能降低DN 大鼠UACR 的升高、改善腎臟病理改變，其發揮以上腎保護作用的機制可能與其抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，進而促進腎臟自噬有關。