背根神經節脈沖射頻術對炎性痛大鼠痛閾及脊髓膠質細胞活化的影響

劉靖芷，史可梅，王曉娟，李全波，王慧星，付強，秦麗媛

外周神經系統脈沖射頻（pulsed radiofrequency，PR）通過神經調控作用起到鎮痛效果，可用于治療頑固性疼痛［1-2］。研究顯示，脊髓星狀膠質細胞和小膠質細胞活化與痛覺過敏的產生和疼痛持續狀態有密切關系［3-4］。有研究表明，炎性痛大鼠可見脊髓膠質細胞的活化［4-5］。脈沖射頻對炎性痛及神經痛大鼠的鎮痛作用已多見報道，但有關脈沖射頻對脊髓膠質細胞活化的影響研究較少，脈沖射頻鎮痛機制尚未明確。本研究擬評價背根神經節脈沖射頻術對炎性痛大鼠脊髓小膠質細胞標記物補體受體-3 的單克隆抗體（clone name of monoclonal antibody of complement receptor type 3,OX42）和星形膠質細胞標記物膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達的影響，以期為闡明背根神經節脈沖射頻術減輕炎性痛的機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雄性SD 大鼠32 只，體質量200～250 g，6～8周齡，由解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。采用隨機數字表法分為對照組（C 組）、脈沖射頻組（PR 組）、炎性痛組（IP組）和炎性痛+脈沖射頻組（IP+PR組）4組（n=8）。

1.2 炎性痛模型制備 除C 組和PR 組外，IP 組和IP+PR 組大鼠參照文獻［6］方法制備炎性痛模型，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，俯臥位固定在固定器上，碘伏消毒右后足底，從右后足跖骨處緩慢注射2.5%福爾馬林（上海銳聰科技發展有限公司）100μL，拔針后用消毒棉按壓針孔，防止藥液流出。C組和PR組同法麻醉下注射等容量生理鹽水。

1.3 疼痛行為學測試 所有大鼠于造模前1 d 和造模后1、3、5和7 d于固定時間（14:00—17:00）在安靜環境下參照文獻［7］測定右后足機械縮足反應閾（MWT），將大鼠置于金屬籠內20 min 后，采用BSEVF3 電子von Frey 纖維絲（Harvard Apparatus公司，美國）于右后足2、3趾骨間垂直施加壓力，記錄出現快速縮足反應、舔舐右足或嘶叫反應時的壓力，測定3次，間隔1 min，取平均值作為MWT，為防止鼠爪損傷，最大壓力設置為50 g，超過此壓力無反應則剔除。參照文獻［8］測定熱縮足潛伏期（TWL），將大鼠置于YSL-6B熱痛儀（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司）的熱板上，記錄從右后足接觸熱板到出現縮足反應、舔舐右足或嘶叫反應的時間，測定5次，間隔20 min，取平均值即為TWL，TWL上限定為30 s以防止燙傷，超過此時間無反應則剔除。

1.4 背根神經節脈沖射頻 于造模后第4天（4 d）腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，俯臥位固定，背部剃毛備皮、碘伏消毒、75%乙醇脫碘后，觸摸大鼠髂嵴最高點，即L5棘突，于L5棘突左側切開皮膚，暴露約3 個棘突的距離，鈍性分離腰背部肌肉，暴露棘突和椎旁肌肉組織，鈍性剝離椎旁軟組織，暴露L4-5橫突及椎間孔，直視下沿神經根走行方向將射頻電極穿刺針（22 G×50×4，英諾曼德醫療科技有限公司，德國）針尖置于L4-5椎間孔內背根神經節，R2000B北琪射頻治療儀（北京北琪醫療科技有限公司）進行阻抗測試，阻抗為400～550 Ω，確認射頻針尖端位于神經組織，PR 組及IP+PR 組進行脈沖射頻術（時間180 s、溫度42 ℃）；C組及IP組僅將射頻電極放置180 s。

1.5 Western blot 檢測GFAP和OX42蛋白表達 于最后1次痛閾測定結束后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，取L4-6脊髓組織，置于-80 ℃冰箱保存。制備脊髓組織勻漿，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用濕式電轉移法（100 V，1 h），轉至硝酸纖維素（PVDF）膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入GFAP 一抗（稀釋度1∶500，Abcam 公司，美國）、OX42 一抗（稀釋度1∶500，Abcam 公司，美國）及β-actin 一抗（稀釋度1∶1 000，Abcam 公司，美國），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的二抗（稀釋度1∶5 000，Abcam 公司，美國）孵育2 h 后，室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次，每次5 min；DAB 顯色，曝光、顯影、定影。采用Quantity One 圖像分析軟件測定條帶光密度值，以目的蛋白條帶光密度值與內參β-actin條帶灰度值比值反映目的蛋白的表達水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，隨機區組設計的計量資料采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗；重復測量設計的計量資料比較采用重復測量資料的方差分析，各組內多時點間比較用Bonferroni法，每個時點多組間比較使用多元方差分析法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠MWT 和TWL 的比較 各組大鼠MWT 和TWL 時間效應與干預措施間差異均有統計學意義，且存在交互作用（P＜0.05），見表1、2。（1）與造模前比較：C組與PR組造模后各時點與造模前比較差異無統計學意義，IP組與IP+PR組造模后MWT和TWL均較造模前降低（P＜0.05），見表1、2。（2）組間比較：造模前各組間MWT 和TWL、造模后各時點C組與PR組間差異均無統計學意義，造模后IP組與IP+PR組均較C組與PR組降低（P＜0.05），IP+PR組較IP 組于脈沖射頻術后即d5 和d7 時升高（P＜0.05），脈沖射頻術前即d1 和d3 時差異無統計學意義，見表1、2。

2.2 各組大鼠OX42 和GFAP 表達水平的比較 與C組和PR組比較，IP組和IP+PR組GFAP和OX42相對表達水平均上調（P＜0.01）；與IP 組比較，IP+PR組GFAP和OX42表達下調（P＜0.01），見圖1、表3。

3 討論

Fig.1 The Western blot results of GFAP and OX42 in four groups圖 1各組大鼠GFAP和OX42的Western blot表達

福爾馬林炎性痛模型廣泛用于炎性痛的實驗研究，通常給予福爾馬林后約3 h大鼠出現舔足縮爪等明顯的疼痛行為學表現，可持續1～2周，因此本研究選用福爾馬林炎性痛模型。本研究結果顯示，IP 組和IP+PR 組造模后與造模前比較，各時點MWT 降低，TWL 縮短，表明大鼠炎性痛模型制備成功。本研究參照文獻［9］的方法行背根神經節脈沖射頻術，與IP組比較，IP+PR組行脈沖射頻術后（d5和d7）出現MWT 升高、TWL 延長，表明背根神經節脈沖射頻術可減輕炎性痛大鼠的痛敏。

脊髓膠質細胞的活化可釋放大量與疼痛傳導和調節機制有關的活性物質，參與疼痛調節過程，與痛覺過敏的產生和持續狀態有密切關系［3-5,10］。星形膠質細胞和小膠質細胞活化后可釋放白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥介質及神經肽P 物質（substance SP），分別激活感覺神經元表面IL-1β和TNF-α受體及脊髓背角感覺神經元表面神經激肽-1 受體，可致神經元興奮性升高，導致痛覺過敏，這些炎性介質參與疼痛的產生和維持［11-14］。小膠質細胞產生的補體受體-3的單克隆抗體為OX42，是小膠質細胞活化的標志物，疼痛產生時，OX42 表達水平增加，表明小膠質細胞活化［3,11］。脊髓星形膠質細胞活化時，其特異性標志物GFAP表達水平增加［13-14］，活化的星形膠質細胞表達谷氨酸轉運體等，可改變突觸間隙谷氨酸濃度，在痛覺調節中起著重要作用［13-15］，因此，本研究檢測脊髓GFAP 和OX42 表達以分別反映星形膠質細胞和小膠質細胞的活化水平。本研究結果顯示，與C 組比較，IP組和IP+PR組炎性痛造模后大鼠脊髓OX42和GFAP表達升高，提示炎性痛大鼠存在脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞的活化；與IP組比較，IP+PR組大鼠行脈沖射頻術后OX42和GFAP表達降低，表明背根神經節脈沖射頻術可抑制炎性痛大鼠脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，結合疼痛行為學檢測結果，提示背根神經節脈沖射頻術減輕大鼠炎性痛的作用可能與抑制脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞的活化相關。綜上，背根神經節脈沖射頻可降低炎性痛大鼠痛敏及抑制脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞的活化。

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各組大鼠MWT的比較 （n=8，g，±s）

Tab.1 Comparison of MWT between the four groups表1 各組大鼠MWT的比較 （n=8，g，±s）

F組間=4 352.340，F時間=1 320.630，F交互=552.675，均P＜0.05；A與d0比較，a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.01；各組內造模后多時點間不作比較；表2同

組別C組PR組IP組IP+PR組造模前（d0）24.77±0.35 25.03±0.43 24.92±0.52 24.86±0.49造模后d1 24.12±0.41 25.11±0.58 12.21±0.35Aab 11.97±0.57Aab d3 23.95±0.61 24.75±0.43 10.02±0.28Aab 9.87±0.43Aab d5 24.13±0.55 24.81±0.63 8.17±0.43Aab 15.77±0.88Aabc d7 24.37±0.46 25.32±0.71 6.77±0.27Aab 17.56±0.67Aabc

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各組大鼠TWL比較 （n=8，s，±s）

Tab.2 Comparison of TWL between the four groups表2 各組大鼠TWL比較 （n=8，s，±s）

F組間=494.215，F時間=111.039，F交互=55.673，均P＜0.05；A與d0比較，a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.01

組別C組PR組IP組IP+PR組造模前（d0）20.8±1.3 21.2±1.2 21.1±1.4 21.2±1.2造模后d7 21.3±1.4 21.1±1.2 6.9±0.9Aab 18.2±1.5Aabc d1 21.1±1.7 21.0±1.1 11.7±1.1Aab 11.4±1.2Aab d3 21.0±1.5 20.9±1.1 9.2±0.7Aab 9.3±0.9Aab d5 20.7±1.8 20.0±1.3 8.1±0.7Aab 15.7±1.3Aabc

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各組大鼠OX42和GFAP表達水平的比較 （n=8，±s）

Tab.3 Comparison of protein expressions of OX42 and GFAP between four groups of rats表3 各組大鼠OX42和GFAP表達水平的比較 （n=8，±s）

＊P＜0.05；a與C組比較，b與PR組比較，c與IP組比較，P＜0.05

組別C組PR組IP組IP+PR組F GFAP 0.61±0.10 0.63±0.09 1.12±0.18ab 0.91±0.12abc 29.301＊OX42 0.35±0.04 0.36±0.03 0.71±0.06ab 0.49±0.05abc 104.527＊