彩葉芋組織快速繁殖技術(shù)研究

吳雅露，王 穎，陳夢濤，應(yīng)鵬飛，蔣玉蓉，陸國權(quán)

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

【研究意義】 彩葉芋（Caladium bicolor）屬天南星科，別名花葉芋、五彩芋，原產(chǎn)于南美洲，為多年生草本植物，因其葉片色彩和圖案豐富而成為觀葉植物中的上品[1-3]，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。自彩葉芋在亞馬遜流域被發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過長期的引種馴化、世代雜交，至今全世界已培育出370多個(gè)專供觀賞的彩葉芋品種[4]。比較常見的栽培品種有白雪彩葉芋（Caladium hortulanum‘Candidum’）、銀翼彩葉芋（C.hortulanum‘Ciation’）、紅艷彩葉芋（C.hortulanum‘Postman Joyner’）、紅脈彩葉芋（C.hortulanum‘Jessiethayer’）、粉紅彩葉芋（C.hortulanum‘Gen.W.B.Halderman’）、 紅點(diǎn)彩葉芋（C.hortulanum‘Marie Moir’）、嬌點(diǎn)彩葉芋（C.hortulanum‘Miss Muffet’）、漆斑彩葉芋（C.hortulanum‘Wightii’）、漆翼彩葉芋（C.hortulanum‘Jody’）等[4-6]。彩葉芋適應(yīng)性較強(qiáng)，在南北方均見栽植，除熱帶地區(qū)可以播種繁殖外，其他地區(qū)因?yàn)闅夂颦h(huán)境等條件的限制，難以自然結(jié)實(shí)，目前主要依靠塊莖分株繁殖[7]。但是，由于塊莖分株繁殖方式具有繁殖系數(shù)低、生長慢、成本高等特點(diǎn)，市場上該花卉價(jià)格普遍較高，且生產(chǎn)供不應(yīng)求[7-8]。組織培養(yǎng)技術(shù)是目前植物快繁最有效的方法之一[9]，并能使物種保持穩(wěn)定的性狀，滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要[10-11]。【前人研究進(jìn)展】 國內(nèi)外學(xué)者早在20世紀(jì)80年代就開始研究彩葉芋的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)[12]，然而近十幾年來關(guān)于彩葉芋組織培養(yǎng)的研究甚少報(bào)道[13]。在彩葉芋離體快繁中，激素的種類與配比是關(guān)鍵因素之一，目前應(yīng)用的激素主要有NAA、6-BA、KT、IAA、2,4-D等。雖然國內(nèi)外對彩葉芋不同生長階段所需的最佳激素配比都進(jìn)行了一些研究，但研究結(jié)果不盡相同[13]。其中，誘導(dǎo)彩葉芋產(chǎn)生愈傷組織的最佳激素配比在MS+6-BA 2～3 mg/L+NAA 0.2～1 mg/L之間。【本研究切入點(diǎn)】 在前人研究基礎(chǔ)上，本研究設(shè)置更多不同濃度的激素組合，以探索6-BA和NAA的不同組合對彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)和分化增殖的影響，確定最佳的生長調(diào)節(jié)劑配比，為促進(jìn)彩葉芋組培快繁技術(shù)研究及實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】 外植體的消毒滅菌以及組織培養(yǎng)物褐化的預(yù)防，是構(gòu)建高效彩葉芋組織快繁系統(tǒng)的關(guān)鍵。因此，研究過程中不可忽視對外植體、培養(yǎng)基及有機(jī)添加物、消毒方法和培養(yǎng)方法等的選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為漆斑彩葉芋（C.hortulanum‘Wightii’）和紅艷彩葉芋（C.hortulanum ‘Postman Joyner’）兩個(gè)品種（圖1），由浙江農(nóng)林大學(xué)提供。

圖1 供試彩葉芋品種Fig.1 Tested Caladium bicolor cultivars

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 取剛抽出未展開的幼嫩葉片為外植體，蒸餾水沖洗干凈后，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%升汞（加入2滴吐溫-80）浸泡5 min，期間輕輕搖動，然后用無菌水沖洗5次。將幼葉切成0.5 cm×0.8 cm左右的小塊，接種到培養(yǎng)基上，接種后15 d按如下公式計(jì)算污染率：

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 選用MS培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)：蔗糖3%、瓊脂0.7%、活性炭0.1%、附加不同濃度的6-BA（2.0、3.0、4.0 mg/L）、NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L），pH 6.0。先暗培養(yǎng)1周，培養(yǎng)溫度25（±2）℃，接著光照時(shí)間12 h/d、光照強(qiáng)度1 500 lx。接種后定期進(jìn)行觀察并統(tǒng)計(jì)啟動時(shí)間和產(chǎn)愈率，其中啟動時(shí)間指從外植體接種到60%以上的外植體出現(xiàn)愈傷組織所需的時(shí)間，統(tǒng)計(jì)時(shí)假設(shè)污染率為0，產(chǎn)愈率計(jì)算公式為：

1.2.3 愈傷組織增殖分化培養(yǎng) 將葉片產(chǎn)生的愈傷組織接種到附加不同濃度6-BA（1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，添加蔗糖3%、瓊脂0.7%、活性炭0.1%，pH 6.0。接種后30 d按如下公式計(jì)算愈傷組織分化率和分化系數(shù)（統(tǒng)計(jì)時(shí)均假設(shè)污染率為0）：

1.2.4 煉苗移栽 把生根良好的彩葉芋試管苗開蓋培養(yǎng)7 d，然后洗凈根部培養(yǎng)基，種植在經(jīng)過高溫消毒的基質(zhì)（由泥炭、蛭石、珍珠巖混合）中，搭塑料薄膜棚保濕，并置于人工氣候室中，7 d后撤去薄膜，定期澆水，30 d后統(tǒng)計(jì)其成活率：

2 結(jié)果與分析

2.1 彩葉芋外植體的消毒滅菌

采用剛抽出未展開的幼嫩葉片為外植體，蒸餾水沖洗后先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%升汞（加入2滴吐溫-80）浸泡5 min，消毒滅菌效果良好，接種15 d后總污染率僅為5.7%，既保證了較低的污染率，又避免過高濃度的消毒劑以及過長的消毒時(shí)間降低愈傷組織的啟動時(shí)間和產(chǎn)愈率。

2.2 彩葉芋愈傷組織的誘導(dǎo)

由表1可知，6-BA濃度在2.0～4.0 mg/L范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)效果，但6-BA、NAA不同濃度組合的誘導(dǎo)效果及愈傷組織的顏色會存在差異，不同組合配比誘導(dǎo)產(chǎn)生漆斑彩葉芋和紅艷彩葉芋葉片愈傷組織的時(shí)間為35～50 d，產(chǎn)愈率均在60%以上。當(dāng)NAA濃度恒定、6-BA濃度為2.0～4.0 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織產(chǎn)生的時(shí)間縮短、產(chǎn)愈率提高，其中以添加有6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的MS培養(yǎng)基效果最好，啟動時(shí)間短，并且產(chǎn)愈率高。

表1 不同NAA、6-BA配比對兩種彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of NAA and 6-BA with different concentration on callus induction of two Caladium bicolor

2.3 彩葉芋愈傷組織的增殖分化

對添加了不同NAA、6-BA配比的培養(yǎng)基愈傷組織分化過程進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表2）表明，當(dāng)NAA濃度保持不變、6-BA濃度為1.0～2.0 mg/L時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，彩葉芋愈傷組織的分化率有明顯提高。其中MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最佳培養(yǎng)基，愈傷組織分化率最高，分化系數(shù)最高，試管苗的生長情況也最好。漆斑彩葉芋組織培養(yǎng)的全流程見圖2。

2.4 彩葉芋組培苗的煉苗移栽

對生根良好的彩葉芋組培苗進(jìn)行馴化移栽，在培養(yǎng)室內(nèi)開蓋培養(yǎng)1周后，小心取出幼苗并洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至由泥炭、蛭石、珍珠巖混合而成的苗床基質(zhì)（提前經(jīng)過高溫消毒）中，苗床上方搭建塑料膜棚保濕，而后置于人工氣候室中。1周后撤除薄膜，定期澆水培養(yǎng)，保證基質(zhì)濕潤，1個(gè)月后漆斑彩葉芋和紅艷彩葉芋的成活率均達(dá)90%以上，植株長勢良好。

表2 不同NAA、6-BA配比對兩種彩葉芋愈傷組織增殖分化的影響Table 2 Effect of NAA and 6-BA with different concentration on callus differentiation of two Caladium bicolor

圖2 漆斑彩葉芋組織培養(yǎng)Fig.2 Tissue culture of Caladium hortulanum ‘Wightii’

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中，只有各種植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合適合的培養(yǎng)基才能很好地誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的啟動、愈傷組織的分化成長以及基本器官的形成[15]。在一定濃度范圍內(nèi)，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織增殖分化影響不同[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在脫分化培養(yǎng)過程中，彩葉芋在不同濃度組合的植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)下均能產(chǎn)生愈傷組織并再生出植株[18]，可見彩葉芋在組織培養(yǎng)中對植物生長調(diào)節(jié)劑的適應(yīng)范圍比較廣，這與李維強(qiáng)等[19]的研究結(jié)論相同。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，采用組培出的彩葉芋植株再進(jìn)行組織培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織的時(shí)間大大縮短、污染率也減少。

愈傷組織誘導(dǎo)的啟動時(shí)間、產(chǎn)愈率、愈傷組織分化率以及愈傷組織分化增殖的能力與彩葉芋品種有關(guān)，本研究試驗(yàn)材料漆斑彩葉芋和紅艷彩葉芋之間的愈傷組織誘導(dǎo)能力存在差異，與李維強(qiáng)等[19]的試驗(yàn)結(jié)果不完全一致。在添加了不同配 比 6-BA（2.0、3.0、4.0 mg/L）、NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L）的9種MS培養(yǎng)基中，以6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生的能力最好；對愈傷組織的增殖分化培養(yǎng)基來說，在6-BA濃度為1.0、2.0 mg/L以及NAA濃度為0.1、0.2、0.5 mg/L范圍內(nèi)，以6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最佳配比。本試驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上，進(jìn)一步細(xì)化了6-BA和NAA的濃度范圍，所設(shè)組合不一，因此得出的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比與前人不完全相同。針對不同品種彩葉芋，可以在最佳植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比上進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置更加精確的濃度梯度配比試驗(yàn)，以促進(jìn)彩葉芋組培快繁技術(shù)的發(fā)展。

褐化是組織培養(yǎng)過程中普遍存在的現(xiàn)象，輕則抑制愈傷組織生長，重則導(dǎo)致外植體迅速死亡。褐變產(chǎn)生的機(jī)理主要是植物組織細(xì)胞受到傷害，導(dǎo)致其還原性物質(zhì)被空氣中的氧氣氧化成醌類物質(zhì)，后者具有細(xì)胞毒性[20-21]。控制褐化比控制污染和玻璃化更加困難。目前通常采用的緩解褐化方法如下：在培養(yǎng)基中適當(dāng)加入活性炭、抗氧化劑（如抗壞血酸），愈傷組織在短時(shí)間內(nèi)反復(fù)轉(zhuǎn)接，適當(dāng)降低溫度和光照，降低激素濃度，降低無機(jī)鹽濃度，在未培養(yǎng)前選取生長活躍的部位等[22-24]。研究表明，添加活性碳、適時(shí)切除褐變部位并及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基、使用添加有椰子水的培養(yǎng)基、采用適宜培養(yǎng)溫度等，均能較好地防止褐變死亡的發(fā)生[25-26]。本試驗(yàn)為解決褐變問題，采用選取剛長出未展開幼葉為外植體、在培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭、暗培養(yǎng)7 d、縮短轉(zhuǎn)接時(shí)間等方法，效果比較好。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L是適合彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，愈傷組織產(chǎn)生快，啟動時(shí)間短，產(chǎn)愈率高，產(chǎn)生的愈傷組織顏色淡綠。漆斑彩葉芋的愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于紅艷彩葉芋，表現(xiàn)為啟動時(shí)間更短、產(chǎn)愈率更高。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L是適合彩葉芋分化增殖的最佳培養(yǎng)基，愈傷組織分化率最高，愈傷組織分化快，能快速長成小植株形態(tài)，試管苗生長情況最好，且無需經(jīng)過誘導(dǎo)生根即可在已形成的苗基部自然生長出幾條淺綠色根。