一株疑似野生大白口蘑的鑒定及菌絲培養基篩選

李文豪，劉 明，康林芝，肖自添，何煥清，徐 江，胡婷婷，劉 主

（1.韶關學院英東生命科學學院，廣東 韶關 512005；2.廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；3.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東 韶關 512005）

【研究意義】 大白口蘑（Tricholoma giganteum）又稱為巨大口蘑、洛巴伊口蘑，是一種大型簇生的食、藥用真菌，隸屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、口蘑科、口蘑屬[1]。大白口蘑的營養價值極高，其粗蛋白和多糖含量分別是115.9 g/kg和365.9 g/kg，含有18種氨基酸，其中人體必需氨基酸74.4 g/kg，滿足FAO/WHO最高蛋白質的需求[2]。大白口蘑含有豐富的礦物質元素，如鋅、鉀、鈣、鐵、鈉、鎂等[3]；還具有防突變、增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗艾滋病毒、抗真菌、降血糖血脂血壓和保護肝臟等功能[4-9]。大白口蘑是一種簇生的野生珍稀食藥用菌，菇體肥大、菌肉鮮美、口感極佳，具有很高的食藥用價值，而且不易褐變和腐爛，耐貯運性好，有很好的開發價值和應用前景[10]。大白口蘑屬于高溫品種，可在夏季市場短缺菇的情況下搶占市場，具有良好的發展前景[11]。韶關學院“食用菌生態循環栽培技術及產業化創新服務團隊”在韶關學院校園內的荒地雜草叢中（旁有苦楝樹和海南蒲桃樹）發現 1 株疑似大白口蘑野生菌。本研究結合形態學特征與ITS序列分析鑒定其分類學地位，并篩選該菌株適宜的菌絲培養基，旨在豐富其種質資源，也為其馴化、栽培和育種提供依據和參考。【前人研究進展】 大白口蘑是由法國真菌學家Hiem發現于非洲，于1970年定名，被稱為“菌中新秀”[12]。文獻報道了從不同地方分離純化得到的野生大白口蘑新品系：卯曉嵐[13]于1992年在香港中文大學校內鳳凰木樹旁草地采集到 1 株；郭翠英等[14]在福建省熱帶植物研究所（廈門）、上官舟建等[15]在荊西地區、湯洪敏等[16]在云南楚雄、鄧優錦等[17]在福建福州、黎金鋒等[18]在廣西南寧、張國廣等[19]在廈門大學、劉月廉等[20]在湛江海洋大學校園內均采集到野生菌株，并進行了分離鑒定和馴化等方面的研究。莫美華等[10]在廣州先后分離到 4 株大白口蘑新品系，分別命名為SCAUI、Dongguanzhuang、SCAU2和SCAU3，并對它們的生物學特性、栽培學特性和品質特性等進行了研究，經過馴化及優化栽培，獲得了4.5萬～7.5萬kg/hm2的產量，而且得到抗雜菌能力強的菌株。粵北具有豐富的野生大型真菌種質資源，畢志樹等在粵北地區采集并鑒定包括擔子菌和子囊菌等大型真菌529種，其中野生食藥用菌113種[21]。據報道，目前粵北地區已知野生食藥用菌共有145種[22]，但沒有發現野生大白口蘑的文獻報道。大白口蘑的商業化栽培范圍較窄，大部分地區仍處于試栽培階段，生產規模較小，制約了該菌的大規模推廣[23]。【本研究切入點】 本團隊在粵北韶關學院校園內中發現 1 株疑似大白口蘑野生菌株，旁有苦楝和海南蒲桃樹。采集并從子實體組織中分離純化得到純菌絲體，菌株命名為Tsg1。本研究結合形態學特征與 ITS 序列分析進行鑒定，并通過在PSA培養基、酵母膏培養基和棉籽殼培養基中的培養試驗，篩選該菌株菌絲培養最合適的培養基。【擬解決的關鍵問題】 通過ITS序列克隆和分析，結合形態學，對野生菌株Tsg1進行鑒定，豐富其生物種質資源；并通過菌絲培養基篩選試驗和野生環境分析，為其開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 野生大白口蘑Tsg1，采自廣東韶關學院校園內荒地雜草叢中，通過組織分離法分離培養得到純化的菌絲體。

1.1.2 試劑 PSA培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH。酵母膏培養基：麥芽糖26 g，酵母膏2 g，MgSO42.7 g，KH2PO41.8 g，維生素B 116 mg，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH。棉籽殼培養基：棉籽殼150 g，麩皮20 g，蒸餾水1 L，煮沸20 min，過濾；濾液中加葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，煮沸后蒸餾水定容至1 L，自然pH。

1.1.3 引物設計與選擇 菌株Tsg1的ITS序列PCR擴增采用真菌ITS通用引物：ITS1，5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4，5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 試驗方法

1.2.1 野生菌株的采集和分離 2016年7月16日，在韶關學院西區的荒地上采集到 1 株野生大型真菌，采用食用菌組織分離法：取1塊黃豆大小的菌蓋與菌柄交界部位的菌肉接種于PSA固體培養基上，30 ℃下培養6 d，然后將得到的純菌絲體轉入PSA斜面培養基中，命名為Tsg1，備用。

1.2.2 野生菌株的鑒定 （1）形態觀察和鑒定。觀察野生菌株子實體的菌蓋、菌褶、菌柄、菌環和菌托等主要構成部分，觀察菌絲體在固體培養基上菌落的形狀、大小、味道、顏色、生活力等，同時采用平板斜插蓋玻片法[24-25]觀測菌絲細胞大小、形態、鎖狀聯合結構等。（2）ITS鑒定。采用FDEB法[26]提取Tsg1基因組DNA，ITS區序列PCR擴增主要參考Ahlawat等[27]的方法。以真菌ITS通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增：10×buffer（無 Mg2+）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，ddH2O 33 μL，Primer（IST1，4）4 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）2 μL，DNA 模板 3 μL，Taq 酶（5 U/μL）1 μL，總體積 50.0 μL。PCR擴增程序：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，以上共32個循環，最后72 ℃延伸10 min。

將PCR產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行正反序列測定。將該序列在GenBank核酸數據庫中進行BLAST，在DNA序列數據庫中搜索同源性高的序列進行比對分析，并用MEGA 7.2軟件對Tsg1的ITS序列進行NJ法聚類分析[28]。構建系統發育樹，分析G含量、C含量、遺傳距離和遺傳進化關系等[29]。

1.2.3 菌絲培養基的篩選 選取一管生長良好的母種，活化后再進行轉接。用接種鉤劃取一黃豆大小的菌塊，接入PSA培養基、酵母膏培養基和棉籽殼培養基中，30 ℃下培養12 d后，觀察測量菌絲的生長速度、色澤、密度和爬壁能力等情況。

試驗數據采用SPSS19.0軟件進行t檢驗統計學分析。

2 結果與分析

2.1 形態觀察和鑒定

該野生蘑菇大型，簇生，初期為半球形或傘形，菌蓋厚，邊緣平滑內卷；后期平展，表面光滑，棕白色，菌蓋直徑5.0～16.0 cm、厚1.9～6.1 cm，平滑或稍粗糙，微粘。菌肉白色至微棕色、厚實、堅韌、嫩脆、有濃厚的蘑菇香味，傷不變色。菌褶白色至淺黃色，直生或彎生，稍密，初期窄后變寬。菌柄中生或偏生，基部往往連合成一叢，實心粗壯，圓柱或倒棒狀，長10.0～25.0 cm、粗3.5～9.0 cm，棕白色，基部肥大略彎，無菌環與菌托（圖1）。孢子表面光滑，球圓或橢圓形，孢子印白色。

圖1 野生大白口蘑（Tsg1）子實體Fig.1 The fruiting bodies of wild Tricholoma giganteum

由圖2可知，在PSA平板中菌絲體呈白色，絮狀，氣生菌絲較多且較致密，但菌絲生長較緩慢，菌絲體3 d后開始擴展。顯微觀察顯示菌絲細胞有隔膜，無色透明，均一，分枝均勻，菌絲直徑2.5～4.0 μm，鎖狀聯合明顯。綜上所述，根據菌株的形態學特征，并參考《中國大型真菌》[30]，初步判斷Tsg1與大白口蘑相似，暫定為“擬野生大白口蘑”。

圖2 野生大白口蘑菌絲鎖狀聯合Fig.2 Clamp connection of wild Tricholoma giganteum （1 000×）

2.2 ITS序列分析與鑒定

采用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4，對疑似野生大白口蘑菌株Tsg1基因組DNA的ITS序列進行PCR擴增，擴增結果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（圖3）。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行正反序列測定。將獲得的正反向序列使用DNAStar軟件包中的SeqMan進行拼接、編輯，獲得完整的ITS序列（序列長度為650 bp，GenBank登記號為MK660795）。

通過NCBI在線BLAST N檢索，該序列與GenBank中報道的大白口蘑JX041888.1、JX068526.1、MK024240.1、MH053153.1、MG867660.1、JX193694.1、KY744346.1、KJ463732.1、JN006792.1、KJ463731.1等菌株序列相似性較高，其Ident約為90%，且E value為0。

通過軟件MEGA7.2分析Tsg1與GenBank中報道的大白口蘑（共25株）的GC含量，結果顯示GC含量在39.0～45.3之間，而Tsg1的GC含量較低，與HM120872.1極為相近、皆為41.8。選擇“Krima2-Paramenter”核酸距離模式進行數據處理，獲得遺傳距離矩陣（圖4）。顯示Tsg1與其他大白口蘑菌株之間的遺傳距離矩陣較小，有著很近的親緣關系。采用N-J（Neighbor-Joining）法構建系統發育樹（圖5）進行聚類分析，結果顯示Tsg1序列與GenBank中報道的大白口蘑（24株）序列具有較高的相似性、Ident在82.23%～90.06%之間，其中與序列JX041888.1相似性最高、Ident為90.06%，與序列KT154007.1相似性較低、Ident為82.23%。因此，結合形態學鑒定可確定Tsg1為大白口蘑新菌株。

圖3 ITS序列PCR擴增結果Fig.3 Result of ITS PCR amplification

2.3 菌絲培養基的篩選

Tsg1菌絲在3種培養基中30 ℃培養12 d，生長情況如圖6（彩版見封三）和表1。圖6和表1顯示，Tsg1菌絲在3種培養基中均能生長，菌絲的長勢存在明顯不同，其生長速度表現為棉籽殼培養基＞酵母膏培養基＞PSA培養基，爬壁能力表現為棉籽殼培養基＞酵母膏培養基＝PSA培養基，菌絲濃密和粗壯度表現為棉籽殼培養基＞PSA培養基＞酵母膏培養基。其中在棉籽殼培養基中菌絲的生長速度最快、長勢最好，菌絲雪白，爬壁能力強，致密健壯。

圖4 大白口蘑的遺傳距離矩陣Fig.4 Genetic distance matrix of Tricholoma giganteum

圖5 新菌株Tsg1與其他大白口蘑的進化樹Fig.5 The phylogenetic tree of new strain Tsg1 and Tricholoma giganteum related species

圖6 Tsg1在3種培養基上的菌絲生長情況Fig.6 The growth situation of Tsg1 in three mycelium culture media

圖6 Tsg1在3種培養基上的菌絲生長情況Fig.6 The growth situation of Tsg1 in three mycelium culture media

表1 Tsg1在3種培養基上菌絲的生長情況Table 1 The mycelium growth situation of Tsg1 in three culture media

3 討論

對野生大型真菌種質資源的收集、馴化是當前科研工作的重點之一。然而，以往對野生大型真菌的鑒定大多依據形態學分類，由于這些依據指標存在一定的主觀性，且有些特征會隨著生長條件的改變而發生變化，這給傳統分類帶來了困難，特別是對于那些形態特征非常相近的種，更是難以準確區分[31]。分子生物學的快速發展為野生真菌的鑒定提供了準確而便捷的方法，采用分子方法進行物種間的分類和鑒定，分析物種間的同源性，更加貼近生物的本原。目前關于真核微生物的鑒定，通常利用其高度保守區rDNA間隔轉錄區間（ITS）特征進行鑒定[32]，因為rDNA的ITS區同時具有保守區和多變區，在真菌系統發育分析以及物種鑒定方面，ITS序列也作為一個有效鑒定真菌種類的分子標記而被廣泛采用[33]。18S、5.8S和28S的序列在進化中趨于保守、種間變化少；然而，內轉錄間隔區ITS1和ITS2作為非編碼區，最終不加入成熟核糖體，受到的選擇壓力較小，進化速度快且變異速度存在較大的種間差異，適合種及種以下水平的分類研究[34]。

本研究在形態學的基礎上，通過ITS序列分析，結合GenBank已有的大白口蘑基因序列特征，最終確定Tsg1為大白口蘑。近年在香港、云南、廣東、湖南、福建等多個地方的夏秋季都發現了野生大白口蘑，在鳳凰木樹旁、羊蹄甲樹旁、榕樹下、竹林中的沃土或草地上叢生[14-20]。本次發現的野生大白口蘑是在苦楝和海南蒲桃樹旁的雜草中，地處粵北的韶關學院校園內。ITS序列分析顯示，該菌株與其他發現的野生菌株存在一定差異，與莫美華等[10,35]在廣州發現的菌 株（JX041888.1、JX068526.1、JX068527.1和JX193694.1）較為相似，其Ident分別為90.06%、89.63%、89.47%和89.58%，這對豐富大白口蘑的野生資源具有積極意義，有利于對本地野生巨大口蘑資源的保護、開發和育種。同時，培養基篩選試驗顯示棉籽殼培養基是該菌株菌絲培養合適的培養基，這為后期相關研究奠定了基礎。

4 結論

本研究團隊在粵北韶關學院內苦楝和海南蒲桃樹旁的雜草中采集到1株疑似大白口蘑野生菌株，采用組織分離法，從野生子實體中分離純化得到純菌絲體。通過ITS序列克隆與序列分析，結合傳統形態學分析，鑒定該菌株為野生大白口蘑，命名為Tsg1。棉籽殼培養基是其菌絲培養適宜培養基。