省沽油葉枯病病原菌的分離鑒定及藥劑篩選試驗(yàn)

陳嘉敏，郭茂超，朱志強(qiáng)，羅美林，魏 蜜

（1．湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000；2．湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062）

【研究意義】 省沽油（Staphylea bumalda）是我國(guó)珍稀的木本油料，主要分布于浙江、江西、云南等省，現(xiàn)在北京及其以南地區(qū)也已廣泛栽培，花白如雪，給人以清新淡雅之感，在園林綠化中應(yīng)用廣泛，是鄂北地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物，具有種植投入少、管理技術(shù)簡(jiǎn)單、適種范圍廣泛、經(jīng)濟(jì)收益豐厚、勞動(dòng)強(qiáng)度適中等優(yōu)點(diǎn)。因此，人工種植省沽油日漸成為農(nóng)民增收的重要渠道，并成為精準(zhǔn)扶貧、產(chǎn)業(yè)扶貧的優(yōu)質(zhì)項(xiàng)目被多地基層政府在貧困山區(qū)廣泛推廣。同時(shí)，省沽油也是一種天然野生食品，其嫩葉和花朵具有很高的食用和藥用價(jià)值，被用作止咳藥、止瀉藥和產(chǎn)后血液清涼劑等[1]，且能夠降低血脂和膽固醇濃度，調(diào)節(jié)血壓，減少老年癡呆癥、癌癥及許多心血管類疾病的發(fā)生，提升人體免疫力等，在開發(fā)為保健食品上有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，種子油含量和質(zhì)量都很好。有研究發(fā)現(xiàn)，種子出油率可達(dá)30%左右[2]，

其嫩葉、嫩梢和花蕾中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素、粗蛋白、總氨基酸和必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分[3]，具有廣泛的應(yīng)用前景。而2017年6月，省沽油葉枯病在湖北省孝感市農(nóng)科院試驗(yàn)園被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率約為30%。受害葉片從葉尖開始發(fā)病，隨后延伸至中部甚至整個(gè)葉片，在大規(guī)模種植條件下該病害可能會(huì)普遍發(fā)生，對(duì)于省沽油工業(yè)的發(fā)展是一個(gè)潛在的巨大風(fēng)險(xiǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 目前，國(guó)內(nèi)還未見有關(guān)于省沽油病害發(fā)生的相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】 為防止該病害大面積發(fā)生，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)該病害病原菌進(jìn)行分離鑒定及防治藥劑篩選研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】 通過(guò)對(duì)樣品的采集、組織分離培養(yǎng)、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，明確了該病害的病原菌種類；并通過(guò)室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)，為省沽油葉枯病綜合防治措施提供一定的理論基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試省沽油葉枯病葉片和健康省沽油植株于2017年6月采自湖北省孝感市農(nóng)科院試驗(yàn)園。供試藥劑：30%三環(huán)·氟環(huán)唑懸浮劑，江蘇豐登作物保護(hù)股份有限公司生產(chǎn)；30%烯?！み漉r胺懸浮劑，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；37%戊唑·咪鮮胺水乳劑，江蘇省農(nóng)墾生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)；80%?！じｄ\可濕性粉劑，山東慧邦生物科技有限公司生產(chǎn)。馬鈴薯購(gòu)于孝感當(dāng)?shù)爻校咸烟呛铜傊?gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[4]：馬鈴薯200 g去皮切碎，沸水加熱30 min，用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)铀a(bǔ)足至1000 mL，加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）則不加瓊脂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離及純化 采用組織分離法[4]對(duì)采集的病害葉片進(jìn)行分離，剪取3 mm×3 mm病健交界處的葉組織，用無(wú)菌水沖洗3次后，用0.1%升汞沖洗3 min，用70%酒精再次沖洗3 min進(jìn)行消毒，再用無(wú)菌水沖洗3次后，移置PDA培養(yǎng)基平板上25℃恒溫培養(yǎng)。將長(zhǎng)出的菌落挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，然后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 根據(jù)科赫氏法則對(duì)分離得到的純化病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。將病原菌置于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量孢子后，加入無(wú)菌水沖洗，收集孢子懸浮液；選擇健康的省沽油葉片，葉片用70%酒精表面消毒后，將孢子懸浮液（1.0 × 106個(gè)孢子/mL）進(jìn)行噴霧接種，以噴灑無(wú)菌水為對(duì)照。接種后14 d觀察葉片發(fā)病情況，并拍照記錄。從接種的有癥狀的葉子中再次重新分離出真菌鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定

（1）病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將純化的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后觀察菌落形態(tài)。培養(yǎng)至產(chǎn)孢后在熒光倒置顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)，選取50～100個(gè)分生孢子測(cè)量其大小取平均值。根據(jù)上述特征進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

（2）病原菌分子生物學(xué)鑒定：參照申光輝等[5]的實(shí)驗(yàn)方法略作改動(dòng)，獲得該病原菌的基因DNA，選用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s、72℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。得到產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比較，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）病原菌脂肪酸鑒定：參照Fernandes等[6]的方法略作改動(dòng)，將病原菌菌落用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（于青島海博生物技術(shù)有限公司購(gòu)買）培養(yǎng)，使用脂肪酸提取劑（皂化試劑、甲基化試劑、萃取試劑和洗滌試劑，美國(guó)Fisher公司提供）對(duì)待測(cè)微生物進(jìn)行脂肪酸提取，提取的脂肪酸通過(guò)全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果通過(guò)微生物細(xì)胞脂肪酸成分鑒定軟件MIS4.5（microbial identification system）和LGS4.5（library generation software）保存記錄，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)菌種的脂肪酸信息進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn) 將已滅菌的PDA培養(yǎng)基溶解，待降到適宜溫度后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）加入藥劑混合均勻倒入滅菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，配成對(duì)應(yīng)濃度的含殺菌劑平板，取新鮮病原菌用6 mm打孔器打取菌餅接種于平板中央，以不加殺菌劑的PDA為對(duì)照，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1皿，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算試驗(yàn)藥劑對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率[7]，將抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值[8]（y），求出供試藥劑濃度的對(duì)數(shù)值（x），用EXCEL建立毒力回歸方程式[9]，求出EC50。

表1 供試藥劑試驗(yàn)濃度Table 1 The concentration of selected fungicides

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化及致病性測(cè)定

用分離純化的病原菌噴霧接種的省沽油葉片（圖1B，彩版見封三）從葉尖開始出現(xiàn)枯黃，隨后延伸至中部甚至整個(gè)葉片，發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的省沽油葉片（圖1A）基本相同。而用無(wú)菌水噴霧的對(duì)照葉片（圖1C）表現(xiàn)為健康狀態(tài)；采取人工接種發(fā)病葉片的病健交界處進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，與最初分離的病原菌形態(tài)一致。根據(jù)柯赫氏法則，說(shuō)明分離的病菌即為省沽油葉枯病致病菌。

圖1 省沽油葉枯病癥狀、致病性試驗(yàn)結(jié)果及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

圖1 省沽油葉枯病癥狀、致病性試驗(yàn)結(jié)果及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

觀察在PDA平板上生長(zhǎng)的分離純化的病原菌，菌落顏色呈青灰色（圖1D），在生長(zhǎng)7 d后長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿( 直徑9 cm) 。在顯微鏡下觀察，分生孢子呈倒棒狀，串聯(lián)成長(zhǎng)鏈狀，大小為3.5～15.8 μm×7.6～46.5 μm，有 2～10個(gè)橫隔膜和 0～3個(gè)縱斜隔膜（圖1E、F）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征初步鑒定該病害是由互隔交鏈孢霉（A.alternate）真菌引起的。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

病原菌的rDNA-ITS 區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得了590 bp 左右的堿基序列，將該序列提交至GenBank（登錄號(hào):MF614038） 。利用 BLAST 搜索，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與A.Alternate MG569550菌株的ITS序列相似度達(dá)99%（圖2）。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征及ITS序列分析，確定該病害病原菌為互隔交鏈孢霉（A.alternate）。

圖2 病原菌ITS聚類分析結(jié)果Fig.2 Dendrogram of cluster analysis on pathogen constructed based on rDNA-ITS sequences

2.4 病原菌脂肪酸鑒定

根據(jù)全自動(dòng)微生物鑒定儀匹配結(jié)果，依據(jù)Buyer等[10]的原則：相似度（similarity index，SI）是指待測(cè)菌株與系統(tǒng)譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)值的匹配程度。相似度＜0.2，結(jié)果不可用。通過(guò)表2脂肪酸鑒定結(jié)果與2.3鑒定結(jié)果相互驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與A.alternate最相似，相似度為0.517。

表2 供試病原菌菌株脂肪酸鑒定結(jié)果Table 2 Results of fatty acid identification of tested pathogen strains

2.5 室內(nèi)藥劑篩選

由表3可知，供試的4種殺菌劑對(duì)省沽油葉枯病的生長(zhǎng)都有抑制作用。其中殺菌劑37%戊唑·咪鮮胺水乳劑EC50最低，為0.400 4 μg/mL，其抑菌效果最好，在藥劑包裝推薦使用濃度基礎(chǔ)上稀釋50倍，其相對(duì)抑菌率達(dá)78.5%，在推薦使用濃度基礎(chǔ)上再稀釋5 000倍，仍有抑菌作用，抑菌率達(dá)42.8%。其次是30%烯酰·咪鮮胺懸浮劑和80%福·福鋅可濕性粉劑，EC50分別為1.461 9、1.756 2 μg/mL，抑菌效果較好，30%烯?！み漉r胺在藥劑包裝推薦使用濃度基礎(chǔ)上稀釋10倍，其相對(duì)抑菌率達(dá)83.7%；80%?！じｄ\在藥劑包裝推薦使用濃度基礎(chǔ)上稀釋20倍，其相對(duì)抑菌率達(dá)82.2%，兩者同時(shí)在推薦使用濃度基礎(chǔ)上再稀釋4 000倍，也仍有抑菌作用，抑菌率達(dá)39%。最后是30%三環(huán)·氟環(huán)唑懸浮劑，EC50為6.055 9 μg/mL，該藥劑在推薦使用濃度基礎(chǔ)上稀釋20倍，抑菌率達(dá)75.8%，在推薦使用濃度基礎(chǔ)上再稀釋1 000倍，抑菌率達(dá)38.4%，相較于37%戊唑·咪鮮胺、30%烯?！み漉r胺和80%?！じｄ\抑菌效果較差。

表3 不同殺菌劑對(duì)病原菌的毒力Table 3 Toxicity of different fungicides on the pathogen

3 討論

鏈格孢屬（Alternaria alternate）是一種全球常見的半知菌暗色絲孢菌，遍布自然界和人類居住的室內(nèi)環(huán)境中，95%以上的種類兼性寄生于植物上。可引起冬棗黑腐病[11]、鴨梨黑斑病[12]、葡萄穗軸褐枯病[13]等水果病害；同時(shí)，鏈格孢屬真菌還廣泛寄生于農(nóng)作物，引起甜瓜[14]、馬鈴薯[15]、大豆[16]、西葫蘆和南瓜[17]等數(shù)十種作物的病害，以及柚木[18]、冬青衛(wèi)矛[19]和單葉蔓荊[20]等園林植物病害，給國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)和水果產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。美國(guó)曾報(bào)道由瓜鏈格孢（A.cucumerina）和茄鏈格孢（A.dauci（Kuhn）Groves et Skolko f.sp.solani）引起的葉斑病和大豆猝倒病極度限制了美國(guó)甜瓜和西葫蘆等的種植，使伊利洛斯州的大豆產(chǎn)量損失15%。在我國(guó)，蔥鏈格孢（A.porri）引起的大蔥紫斑病限制我國(guó)蔥的出口，造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)5 000萬(wàn)元[21]。因此，為避免省沽油在產(chǎn)業(yè)化種植中出現(xiàn)該病害浸染，對(duì)該病害的鑒定及初步防治研究十分必要。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)田間調(diào)查和采集樣品，使用柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定，并利用形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)和脂肪酸鑒定，明確了省沽油葉枯病的病原菌為互隔交鏈孢霉（A.alternate）。經(jīng)過(guò)查閱國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，由A.alternate引起的省沽油葉枯病為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。同時(shí)為了避免該病害發(fā)生時(shí)盲目使用殺菌劑，對(duì)該病害進(jìn)行室內(nèi)防治藥劑篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在供試藥劑中，戊唑·咪鮮胺抑菌效果最好，EC50為0.4004 g/mL，其次是烯?！み漉r胺、?！じｄ\和三環(huán)·氟環(huán)唑。但室內(nèi)藥劑篩選結(jié)果由于采用平板打孔法測(cè)定，結(jié)果會(huì)受到藥劑擴(kuò)散能力與藥劑產(chǎn)品批號(hào)等的影響，具一定局限性。因此，本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果只可為省沽油葉枯病的田間藥劑防治試驗(yàn)提供借鑒基礎(chǔ)。