茵陳蒿湯對急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠腸道黏膜屏障和NF-κB的影響*

李京濤,焦俊喆,魏海梁,閆曙光,李日向,常占杰,郭英君

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 (咸陽 712046)；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) (咸陽 712046)；3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 (銀川 750001)

急性肝內(nèi)膽汁淤積屬于臨床難治的一類疾病，發(fā)病機(jī)制與肝細(xì)胞和(或)毛細(xì)膽管膽汁分泌障礙或肝內(nèi)膽管梗阻有關(guān)[1]。而新近研究發(fā)現(xiàn)，急性肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生發(fā)展與腸黏膜屏障的破壞明顯相關(guān)[2-4]。茵陳蒿湯是臨床上治療急性肝內(nèi)膽汁淤積的經(jīng)典方藥，此方可明顯改善肝病高黃疸患者肝功能、促進(jìn)膽紅素代謝及緩解消化道不適癥狀[5-7]，但是否具有保護(hù)腸道黏膜屏障的作用，尚不清楚。本研究制備急性肝內(nèi)膽汁淤積SD大鼠模型，觀察茵陳蒿湯對大鼠腸道黏膜屏障及肝組織NF-κB表達(dá)的影響，從而探討茵陳蒿湯對腸道黏膜屏障保護(hù)機(jī)制，為中醫(yī)藥治療急性肝內(nèi)膽汁淤積提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物: 健康幼年雄性清潔級SD大鼠70只，日齡21 d，體重(80±20)g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供，飼料隔日更換1次，自由攝取食水，環(huán)境室溫(22±1)℃，相對濕度40%～60%。

1.2 藥物制備:茵陳蒿湯方藥均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購買和制備成凍干粉，符合中國藥典(2015版)要求，每克含生藥8 g，凍干粉密封保存于4 ℃ 冰箱內(nèi)備用，使用時100 ℃水溶解，使用時配置為劑量為1 g/ml的藥液。

1.3 主要試劑與儀器:ANIT(美國Sigma)；NF-κB ELISA試劑盒(南京森貝伽)；蘇木素、伊紅(陜西博達(dá))；圖像采集系統(tǒng)：NIKON．ACT-1DXM1200日本尼康公司；光學(xué)顯微鏡：蔡司光學(xué)儀器(上海)公司；病理組織切片機(jī)(湖北泰維)，型號：TB-718EL。

2 實驗方法

2.1 實驗分組:70 只大鼠按照體重隨機(jī)分為正?？瞻捉M(10 只)，模型組(30 只)、中藥組(30 只)，其中中藥組和模型組又按灌服ANIT 后24 h、48 h、72 h 3個時間點分為3 組，每組10 只。

2.2 造模和給藥: 各組幼鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。造模方法：按50 mg/kg給予幼鼠一次性灌服1 % ANIT溶液，空白組按50 mg/kg灌服麻油，所有組灌胃前后12 h只進(jìn)水不進(jìn)食。造模前3 d予中藥組灌服茵陳蒿湯液(每次4 ml/kg，2次/d)至實驗結(jié)束，空白組和模型組每天同時灌服等量生理鹽水。造模后分24 h、48 h和72 h三個時間點處死幼鼠，空白組于48 h時間點全部處死。

2.3 標(biāo)本采集:各組幼鼠腹腔注射6 %水合氯醛進(jìn)行麻醉后處死，經(jīng)腹主動脈采血3 ml，擬行肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)檢測。解剖小腸組織，并行環(huán)形切取，生理鹽水沖洗，盡量將組織平展，之后用4 %多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片。另取部分小腸組織置于2.5 %的戊二醛固定，送電鏡室觀察。

3 觀察項目及方法 一般情況觀察。肝功測定：將抽取的動脈血在冰上靜置30 min 后，按4000 r/min離心10 min，小心吸取上層清亮血清，全自動生化分析儀檢測肝功能(ALT、ALP、GGT、TBIL)數(shù)值。腸組織HE染色：取部分小腸組織，按照病理組織標(biāo)準(zhǔn)流程制作電鏡組織切片以及蘇木精-伊紅染色組織片，評估各組組織學(xué)形態(tài)變化。肝組織NF-κB檢測：取48 h時各組肝臟組織大小為15 mm×12 mm×5 mm置入EP管中，做肝組織勻漿，離心后提取上清液于EP管中，ELISA法檢測勻漿中NF-κB量，操作按照試劑盒說明進(jìn)行。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計方法選擇One-WAY ANOVA方差分析法，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組一般情況比較 空白組：在造模過程中毛色光亮，活動靈敏，進(jìn)食量及尿色均良好。模型組：造模過程中毛色暗淡，活動遲鈍，進(jìn)食量減少，尿色較空白組對比明顯加深。中藥組：與模型組比較，中藥組大鼠活動、進(jìn)食量及尿色均明顯改善。

2 各組生化指標(biāo)比較 如表1所示，與空白組比較，中藥組與模型組大鼠均出現(xiàn)ALT、ALP、GGT、TBIL的迅速升高。中藥組24 h與模型組24 h比較，ALT及TBIL明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在造模48 h后，中藥組與模型組ALT、TBIL均達(dá)到高峰，且兩組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模72 h后，中藥組與模型組ALT、TBIL均較同組造模48 h下降，且兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而在造模后24 h及48 h兩個時間點比較，中藥組的 ALP、GGT均低于模型組，但均無統(tǒng)計學(xué)差異；至造模72 h后，中藥組ALP、GGT指標(biāo)改善明顯優(yōu)于同期模型組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 各組腸黏膜HE染色比較 空白組的腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，清晰完整，且絨毛排列整齊。造模24 h后，模型組腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，可見腸黏膜絨毛不同程度縮短、斷裂。與模型組對比，中藥組的腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞和絨毛結(jié)構(gòu)改變均較輕。造模后48 h及72 h，模型組出現(xiàn)較嚴(yán)重的腸黏膜絨毛改變，絨毛不同程度壞死、脫落，萎縮，排列雜亂，同時期中藥組較模型組病理改變較輕。

4 各組肝組織中NF-κB檢測比較 見表2。中藥組與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 各組腸黏膜改變情況(HE染色，×100)

組 別nALT(U/L)ALP(μmol/L)GGT(U/L)TBIL(μmol/L)空白組48 h1040.90±3.67207.70±25.822.45±0.620.40±0.14模型組24 h101039.70±155.56559.30±53.296.73±0.8776.86±5.27模型組48 h101332.00±229.53772.30±51.377.53±1.06199.10±37.36模型組72 h10466.60±132.10784.20±50.528.41±0.80108.75±24.32中藥組24 h10689.80±107.22?505.40±58.566.48±0.7649.39±6.30?中藥組48 h10971.50±115.32?710.40±42.107.29±0.64140.49±26.32?中藥組72 h10206.20±74.49?713.10±31.69?7.35±0.62?59.45±12.89?

注：與同期模型組比較，*P<0.05

表2 各組大鼠肝組織NF-κB的變化(ng/L)

注：與模型組比較，#P<0.01

討 論

急性肝內(nèi)膽汁淤積時，膽汁流入十二指腸發(fā)生障礙，造成腸黏膜屏障及腸道內(nèi)微生態(tài)的破壞，腸道大量內(nèi)毒素和細(xì)菌通過受損的腸黏膜屏障易位進(jìn)入門靜脈系統(tǒng)并釋放出多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，使得腸黏膜屏障解剖和功能的完整性發(fā)生進(jìn)一步破壞，而淤膽造成的肝細(xì)胞炎癥損傷又進(jìn)一步加重膽汁淤積，持續(xù)破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致了病情的持續(xù)進(jìn)展。本實驗發(fā)現(xiàn)與模型組對比，灌服茵陳蒿湯的大鼠病理學(xué)顯示小腸腸腔僅輕度擴(kuò)大，小腸腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞和絨毛結(jié)構(gòu)改變均較輕。提示本方可能通過改善腸黏膜上皮細(xì)胞之間的緊密連接從而改善腸黏膜通透性，減輕腸組織損傷。

NF-κB是處于炎癥及免疫反應(yīng)風(fēng)暴中心的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其與多種細(xì)胞因子的合成與釋放密切相關(guān)[8]。胞漿中大量活化的NF-κB復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，可以誘導(dǎo)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，同時還可刺激多種細(xì)胞因子的表達(dá)(如TNF-α、IL-2、IL-6)，而諸多細(xì)胞因子的過表達(dá)又可反向增強(qiáng)NF-κB的活化，造成持續(xù)的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子“瀑布樣”效應(yīng)[9]。急性肝內(nèi)膽汁淤積時，腸道黏膜機(jī)械屏障完整性被破壞，腸道內(nèi)大量細(xì)菌及內(nèi)毒素發(fā)生移位，刺激肝臟NF-κB的持續(xù)高表達(dá)，NF-κB的高表達(dá)進(jìn)一步導(dǎo)致肝功能的惡化甚至肝衰竭的發(fā)生。本次實驗結(jié)果顯示茵陳蒿湯可下調(diào)肝組織NF-κB的過度表達(dá)，其機(jī)制可能與茵陳蒿湯保護(hù)腸黏膜屏障，降低了腸道黏膜通透性，從而減少了肝組織NF-κB的表達(dá)。

茵陳蒿湯是臨床治療肝內(nèi)膽汁淤積濕熱證型最常用的方劑之一。方中茵陳蒿為君藥，清熱利濕、疏利肝膽;臣以梔子清泄三焦火熱，利濕退黃;而大黃具有通導(dǎo)濕熱以泄邪外出的功效，為佐藥。茵陳蒿湯可通過調(diào)控肝膽細(xì)胞膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)、促進(jìn)膽紅素代謝、抑制氧化應(yīng)激等各方面治療急性肝內(nèi)膽汁淤積[10]。本研究提示茵陳蒿湯對急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠腸道黏膜的保護(hù)機(jī)制可能與上調(diào)腸黏膜機(jī)械屏障中的緊密連接相關(guān)蛋白，減少腸黏膜通透性，降低了肝臟NF-κB的表達(dá)有關(guān)。本研究證實了茵陳蒿湯治療急性肝內(nèi)膽汁淤積的有效性，為茵陳蒿湯在肝內(nèi)膽汁淤積中的應(yīng)用提供了實驗證據(jù)。