血清miR-133、CTGF水平與糖尿病腎病分期和中醫證候的關系研究

陸聆韻 袁 民

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院中醫科 上海 201801)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管系統并發癥之一[1]，目前對于DN各個分期階段中醫證候的分布特點研究甚少。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是近年來新發現的一種細胞因子，與腎小球硬化和腎小管間質纖維化密切相關[2]。除此以外，miR-133b是CTGF的上游調控基因，可抑制腎小管上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[3]，但是是否與DN患者中醫證候和分期相關尚缺乏足夠的證據支持。因此，本文通過觀察不同分期、不同中醫證候DN患者血清miR-133和CTGF表達的差異性，為中醫辨證治療提供新的參考思路。

1 臨床資料

1.1 病例來源

本項研究選取2016年9月～2018年1月在我院確診為2型糖尿病患者282例，男性119例，女性163例，年齡18～82歲，平均年齡(60.37±12.82)歲。入選標準：(1)具有確切的2型糖尿病病史；(2)年齡≥18歲。排除標準：(1)腎功能迅速惡化，短期內出現大量蛋白尿或合并腎病綜合征；(2)頑固性高血壓；(3)合并原發性腎小球疾病或明顯異常管型，腎小管功能異常者；(4)合并嚴重感染、電解質紊亂、糖尿病酮癥酸中毒者。該研究方案經我院倫理委員會批準，且與所有患者簽署了知情同意書。

1.2 診斷和分期標準

1.2.1DN患者診斷及分期標準[4]

根據丹麥Mogensen分期標準：(1)I期即為腎單位濾過增高期，腎小球濾過率增加，腎臟體積增大，尿白蛋白呈陰性，無明顯組織病理學改變，腎小球毛細血管灌注壓升高；(2)Ⅱ期即為正常白蛋白尿期，無異常尿白蛋白，腎小球基底膜增厚，系膜基質增生，腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)異常升高；(3)Ⅲ期即為早期DN期，尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)為20～200μg/min，24h尿白蛋白維持在30～300mg；出現腎小球結節或彌漫性病變以及腎小球動脈玻璃樣病變；(4)Ⅳ期即為臨床DN期，UAE>200μg/min，或者24h尿蛋白定量>300mg；出現持續性蛋白尿，高血壓，并伴有水腫。

1.2.2中醫證候診斷標準

參考《消渴病中醫臨床路徑》[5]和《糖尿病腎病診辯證分型及療效評定標準(2007試行方案)》[6]，由我科室資深中醫師對DN患者進行四診，并依據臨床癥狀和舌苔脈象對DN患者進行中醫辨證分型，根據主證可分為氣陰兩虛型、脾腎氣虛型、氣陽兩虛型、陰陽兩虛型，兼證分為痰濁、濕熱、氣滯、淤血、熱結、郁熱、水濕七型。

1.3 研究方法

1.3.1CTGF檢測：采集患者入院時的外周靜脈血3mL，采用ELISA試劑盒(美國R&D公司)檢測CTGF水平。

1.3.2實時定量聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法：采用TRIzol試劑盒(日本Takara公司)提取總RNA。根據Taqman?MicroRNA reverse transcription kit和Taqman?MicroRNA assay kit試劑盒(日本Takara公司)說明書進行逆轉錄反應。按照三步法進行PCR擴增，將20μL反應體系置于37℃恒溫水浴60min，85℃5s，加入去離子水至100μL，各反應孔取2μL進行PCR。冰浴中配制20μL PCR反應體系，95℃30s預變性，95℃5s，60℃30s，循環45次。miR-133(F：5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'；R：5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3')；內參U6(F：5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'；R：5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3')。根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 血清miR-133、CTGF與DN不同分期的關系

共納入282例2型糖尿病患者，包括124例單純糖尿病患者，即Mogensen分期I期和Ⅱ期患者；86例早期DN患者，即Mogensen分期Ⅲ期患者；72例臨床期DN患者，即Mogensen分期Ⅳ期患者。單純糖尿病患者、早期DN患者、臨床期DN患者血清miR-133和CTGF水平存在統計學差異(P<0.05)，且隨著病情進展，血清miR-133表達量逐漸降低，而CTGF表達量逐漸升高，見表1。

表1 不同分期DN患者血清miR-133和CTGF水平的差異性

指標單純糖尿病(n=124)早期DN(n=86)臨床期DN(n=72)FP值miR-1331.70±0.351.04±0.31a0.72±0.28ab237.9150.000CTGF(pg/mL)0.18±0.140.57±0.20a0.69±0.21ab223.1310.000

注：a與單純糖尿病組患者相比，P<0.05；b與早期DN組患者相比，P<0.05。

2.2 血清miR-133、CTGF與DN不同中醫證型的關系

不同證型患者miR-133和CTGF水平均存在統計學差異(P<0.05)。其中脾腎氣虛型患者血清miR-133水平最高，陰陽兩虛型患者血清miR-133水平最低，與其他患者相比，存在統計學差異(P<0.05)，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清miR-133水平基本一致，無統計學差異(P>0.05)。另外，脾腎氣虛型患者血清CTGF水平最低，陰陽兩虛型患者血清CTGF水平最高，與其他患者相比，存在統計學差異(P<0.05)，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清CTGF水平基本一致，無統計學差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同中醫證型DN患者血清miR-133和CTGF水平的差異性

指標氣陰兩虛(n=116)脾腎氣虛(n=89)氣陽兩虛(n=45)陰陽兩虛(n=32)FP值miR-1331.17±0.451.42±0.41a1.16±0.37b1.05±0.39abc9.2710.000CTGF(pg/mL)0.58±0.150.27±0.16a0.54±0.19b0.72±0.17abc102.2090.000

注：a與氣陰兩虛型患者相比，P<0.05；b與脾腎氣虛型患者相比，P<0.05；c與氣陽兩虛型患者相比，P<0.05。

3 討論

糖尿病腎病是晚期糖尿病患者主要微血管病變之一，死亡率較高，目前臨床上對于DN患者的分期標準一直是沿用丹麥Mogensen分期。近幾年，隨著中醫學理論的深入研究，DN逐漸成為中醫治療領域的重要疾病之一。多項研究證實，通過中醫辨證施治，可顯著改善DN患者蛋白尿，甚至可逆轉腎損傷[7]。目前中醫對于DN的治療仍然存在一定的弊端，如證候判斷缺乏客觀化指標，過分倚重主觀經驗評估靶器官損傷的嚴重程度和病情進展的復雜程度，從而影響辨證論治的客觀化和可重復性。因此，從現代藥理學角度分析DN的發病機制，選擇敏感的監測指標，不僅有利于DN的診斷和分期，而且也可以結合中醫證候對患者進行辨證論治。CTGF是近年來關注度較高的腎損傷標志分子之一，在正常生理狀態下，血清中CTGF的含量極微，但是在受損的腎臟中表達量迅速升高[8]。另外，有研究顯示，miR-133可減緩心肌纖維化，通過作用于CTGF靶點抑制膀胱平滑肌上皮細胞發生間質化轉化，同時也是抑制腎小管上皮細胞間質化轉化的重要機制[9]。在本項研究中，我們首先證實miR-133和CTGF與DN分期密切相關，隨著病情的進展，血清miR-133表達量逐漸降低，而CTGF表達量逐漸升高。

DN發病機制復雜，辨證也變化多端，從本虛證和證實候分析，以組合形式為最常見，可出現氣陰兩虛證、脾腎氣虛證、氣陽兩虛證、陰陽兩虛證；標實候也多見痰濁、濕熱、氣滯、淤血、熱結、郁熱、水濕七型。在糖尿病腎病早中期階段，多以腎氣不足為主，血瘀、熱結貫穿始終；而在中晚期階段，腎元虛衰愈甚，濕濁邪毒內生，多見氣虛血虧，本虛證可兼陰虛、陽虛，或陰陽兩虛證。因此，隨著病情進展，本虛證也是經由“陰虛證-氣陰兩虛證-氣陽兩虛證-氣血兩虛證”而發展[10]。另外，在本項研究中，我們發現血清miR-133、CTGF在不同中醫證候患者中的表達水平存在明顯的差異性。其中脾腎氣虛型患者血清miR-133水平最高，CTGF水平最低，陰陽兩虛型患者血清miR-133水平最低，CTGF水平最高，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清miR-133和CTGF水平基本一致。miR-133和CTGF主要由腎足細胞分泌，miR-133表達量降低，CTGF分泌量升高，提示陰陽兩虛證患者腎小球足細胞損傷最為嚴重，其次為氣陰兩虛證和氣陽兩虛證患者。

綜上所述，我們發現血清miR-133和CTGF與DN分期和中醫證候存在一定的相關性，可作為中西醫結合治療DN的連接點，從而為中醫辨證論治提供了客觀化參考指標。