血清miR-133、CTGF水平與糖尿病腎病分期和中醫(yī)證候的關(guān)系研究

陸聆韻 袁 民

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院中醫(yī)科 上海 201801)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管系統(tǒng)并發(fā)癥之一[1]，目前對(duì)于DN各個(gè)分期階段中醫(yī)證候的分布特點(diǎn)研究甚少。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，與腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)[2]。除此以外，miR-133b是CTGF的上游調(diào)控基因，可抑制腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[3]，但是是否與DN患者中醫(yī)證候和分期相關(guān)尚缺乏足夠的證據(jù)支持。因此，本文通過觀察不同分期、不同中醫(yī)證候DN患者血清miR-133和CTGF表達(dá)的差異性，為中醫(yī)辨證治療提供新的參考思路。

1 臨床資料

1.1 病例來源

本項(xiàng)研究選取2016年9月～2018年1月在我院確診為2型糖尿病患者282例，男性119例，女性163例，年齡18～82歲，平均年齡(60.37±12.82)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有確切的2型糖尿病病史；(2)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎功能迅速惡化，短期內(nèi)出現(xiàn)大量蛋白尿或合并腎病綜合征；(2)頑固性高血壓；(3)合并原發(fā)性腎小球疾病或明顯異常管型，腎小管功能異常者；(4)合并嚴(yán)重感染、電解質(zhì)紊亂、糖尿病酮癥酸中毒者。該研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且與所有患者簽署了知情同意書。

1.2 診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1DN患者診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)[4]

根據(jù)丹麥Mogensen分期標(biāo)準(zhǔn)：(1)I期即為腎單位濾過增高期，腎小球?yàn)V過率增加，腎臟體積增大，尿白蛋白呈陰性，無明顯組織病理學(xué)改變，腎小球毛細(xì)血管灌注壓升高；(2)Ⅱ期即為正常白蛋白尿期，無異常尿白蛋白，腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)異常升高；(3)Ⅲ期即為早期DN期，尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAE)為20～200μg/min，24h尿白蛋白維持在30～300mg；出現(xiàn)腎小球結(jié)節(jié)或彌漫性病變以及腎小球動(dòng)脈玻璃樣病變；(4)Ⅳ期即為臨床DN期，UAE>200μg/min，或者24h尿蛋白定量>300mg；出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，高血壓，并伴有水腫。

1.2.2中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考《消渴病中醫(yī)臨床路徑》[5]和《糖尿病腎病診辯證分型及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)(2007試行方案)》[6]，由我科室資深中醫(yī)師對(duì)DN患者進(jìn)行四診，并依據(jù)臨床癥狀和舌苔脈象對(duì)DN患者進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，根據(jù)主證可分為氣陰兩虛型、脾腎氣虛型、氣陽兩虛型、陰陽兩虛型，兼證分為痰濁、濕熱、氣滯、淤血、熱結(jié)、郁熱、水濕七型。

1.3 研究方法

1.3.1CTGF檢測(cè)：采集患者入院時(shí)的外周靜脈血3mL，采用ELISA試劑盒(美國R&D公司)檢測(cè)CTGF水平。

1.3.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)法：采用TRIzol試劑盒(日本Takara公司)提取總RNA。根據(jù)Taqman?MicroRNA reverse transcription kit和Taqman?MicroRNA assay kit試劑盒(日本Takara公司)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將20μL反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴60min，85℃5s，加入去離子水至100μL，各反應(yīng)孔取2μL進(jìn)行PCR。冰浴中配制20μL PCR反應(yīng)體系，95℃30s預(yù)變性，95℃5s，60℃30s，循環(huán)45次。miR-133(F：5'-CTTGGCATTGAGTGAAAGAAC-3'；R：5'-ACAGGAGATAGGCTGGTTTGA-3')；內(nèi)參U6(F：5'-CATTGGGAGTTTCAAATCAGC-3'；R：5'-CTTTGCATTCTTGGACGAGG-3')。根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清miR-133、CTGF與DN不同分期的關(guān)系

共納入282例2型糖尿病患者，包括124例單純糖尿病患者，即Mogensen分期I期和Ⅱ期患者；86例早期DN患者，即Mogensen分期Ⅲ期患者；72例臨床期DN患者，即Mogensen分期Ⅳ期患者。單純糖尿病患者、早期DN患者、臨床期DN患者血清miR-133和CTGF水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且隨著病情進(jìn)展，血清miR-133表達(dá)量逐漸降低，而CTGF表達(dá)量逐漸升高，見表1。

表1 不同分期DN患者血清miR-133和CTGF水平的差異性

指標(biāo)單純糖尿病(n=124)早期DN(n=86)臨床期DN(n=72)FP值miR-1331.70±0.351.04±0.31a0.72±0.28ab237.9150.000CTGF(pg/mL)0.18±0.140.57±0.20a0.69±0.21ab223.1310.000

注：a與單純糖尿病組患者相比，P<0.05；b與早期DN組患者相比，P<0.05。

2.2 血清miR-133、CTGF與DN不同中醫(yī)證型的關(guān)系

不同證型患者miR-133和CTGF水平均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。其中脾腎氣虛型患者血清miR-133水平最高，陰陽兩虛型患者血清miR-133水平最低，與其他患者相比，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清miR-133水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。另外，脾腎氣虛型患者血清CTGF水平最低，陰陽兩虛型患者血清CTGF水平最高，與其他患者相比，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清CTGF水平基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同中醫(yī)證型DN患者血清miR-133和CTGF水平的差異性

指標(biāo)氣陰兩虛(n=116)脾腎氣虛(n=89)氣陽兩虛(n=45)陰陽兩虛(n=32)FP值miR-1331.17±0.451.42±0.41a1.16±0.37b1.05±0.39abc9.2710.000CTGF(pg/mL)0.58±0.150.27±0.16a0.54±0.19b0.72±0.17abc102.2090.000

注：a與氣陰兩虛型患者相比，P<0.05；b與脾腎氣虛型患者相比，P<0.05；c與氣陽兩虛型患者相比，P<0.05。

3 討論

糖尿病腎病是晚期糖尿病患者主要微血管病變之一，死亡率較高，目前臨床上對(duì)于DN患者的分期標(biāo)準(zhǔn)一直是沿用丹麥Mogensen分期。近幾年，隨著中醫(yī)學(xué)理論的深入研究，DN逐漸成為中醫(yī)治療領(lǐng)域的重要疾病之一。多項(xiàng)研究證實(shí)，通過中醫(yī)辨證施治，可顯著改善DN患者蛋白尿，甚至可逆轉(zhuǎn)腎損傷[7]。目前中醫(yī)對(duì)于DN的治療仍然存在一定的弊端，如證候判斷缺乏客觀化指標(biāo)，過分倚重主觀經(jīng)驗(yàn)評(píng)估靶器官損傷的嚴(yán)重程度和病情進(jìn)展的復(fù)雜程度，從而影響辨證論治的客觀化和可重復(fù)性。因此，從現(xiàn)代藥理學(xué)角度分析DN的發(fā)病機(jī)制，選擇敏感的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，不僅有利于DN的診斷和分期，而且也可以結(jié)合中醫(yī)證候?qū)颊哌M(jìn)行辨證論治。CTGF是近年來關(guān)注度較高的腎損傷標(biāo)志分子之一，在正常生理狀態(tài)下，血清中CTGF的含量極微，但是在受損的腎臟中表達(dá)量迅速升高[8]。另外，有研究顯示，miR-133可減緩心肌纖維化，通過作用于CTGF靶點(diǎn)抑制膀胱平滑肌上皮細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)化轉(zhuǎn)化，同時(shí)也是抑制腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制[9]。在本項(xiàng)研究中，我們首先證實(shí)miR-133和CTGF與DN分期密切相關(guān)，隨著病情的進(jìn)展，血清miR-133表達(dá)量逐漸降低，而CTGF表達(dá)量逐漸升高。

DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，辨證也變化多端，從本虛證和證實(shí)候分析，以組合形式為最常見，可出現(xiàn)氣陰兩虛證、脾腎氣虛證、氣陽兩虛證、陰陽兩虛證；標(biāo)實(shí)候也多見痰濁、濕熱、氣滯、淤血、熱結(jié)、郁熱、水濕七型。在糖尿病腎病早中期階段，多以腎氣不足為主，血瘀、熱結(jié)貫穿始終；而在中晚期階段，腎元虛衰愈甚，濕濁邪毒內(nèi)生，多見氣虛血虧，本虛證可兼陰虛、陽虛，或陰陽兩虛證。因此，隨著病情進(jìn)展，本虛證也是經(jīng)由“陰虛證-氣陰兩虛證-氣陽兩虛證-氣血兩虛證”而發(fā)展[10]。另外，在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清miR-133、CTGF在不同中醫(yī)證候患者中的表達(dá)水平存在明顯的差異性。其中脾腎氣虛型患者血清miR-133水平最高，CTGF水平最低，陰陽兩虛型患者血清miR-133水平最低，CTGF水平最高，而氣陰兩虛型患者和氣陽兩虛型患者血清miR-133和CTGF水平基本一致。miR-133和CTGF主要由腎足細(xì)胞分泌，miR-133表達(dá)量降低，CTGF分泌量升高，提示陰陽兩虛證患者腎小球足細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，其次為氣陰兩虛證和氣陽兩虛證患者。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)血清miR-133和CTGF與DN分期和中醫(yī)證候存在一定的相關(guān)性，可作為中西醫(yī)結(jié)合治療DN的連接點(diǎn)，從而為中醫(yī)辨證論治提供了客觀化參考指標(biāo)。