胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的劑量和時間窗研究

于春華，宋夢，曲憲成，王麗麗，王遠

（1.山東省青島市中心醫院，山東青島266000；2.山東省青島市第九人民醫院藥劑科，山東青島266000）

胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的劑量和時間窗研究

于春華1，宋夢1，曲憲成1，王麗麗1，王遠2

（1.山東省青島市中心醫院，山東青島266000；2.山東省青島市第九人民醫院藥劑科，山東青島266000）

目的研究胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的最佳劑量和時間窗。方法通過雙側頸總動脈結扎法（BCCAO）建立大鼠前腦缺血模型，采用正交試驗設計分組，經由腹腔注射胡黃連苷Ⅱ干預治療，應用黃嘌呤氧化酶法、化學比色法和光化學法分別檢測血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）的活性。結果根據血清SOD，GSHPx和CAT活性分析，應用胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳效果為腦缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg，1.5 h/10（mg·kg）和1.5 h/20（mg·kg）。結論胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5～2.0 h和腹腔注射10～20 mg/kg。

胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；劑量；時間窗；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；過氧化氫酶；大鼠

腦缺血損傷會導致一系列病理過程，如能量代謝障礙、離子平衡失調、自由基過度生成等。生理狀態下，體內不斷生成的自由基由抗氧化系統清除，維持動態平衡［1］。超氧化物歧化酶（SOD）與超氧陰離子反應生成過氧化氫（H2O2），再由谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）將H2O2分解為分子氧和水，消除氧自由基的毒性作用［2］。故SOD活性可反映機體清除氧自由基（OFR）的能力。細胞培養證實，胡黃連苷Ⅱ可通過減輕H2O2誘導的PC12細胞損傷而提高細胞存活率［3-5］。動物試驗表明，胡黃連苷Ⅱ能通過調節誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、SOD和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的表達，抑制腦缺血-再灌注損傷引起的細胞凋亡［6-7］。李紅云等［8］的研究顯示，大鼠腦缺血損傷后1.5 h，經腹腔注射胡黃連苷Ⅱ20 mg/kg可獲得較好療效。本研究中通過定量檢測血清抗氧化酶活性變化，以確定胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷最佳治療劑量和時間窗，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與試藥

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠35只，體重230～250 g，青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供，合格證號SCXK（魯）20120010。胡黃連苷Ⅱ（純度不低于98%，相對分子質量為512.46，上海純優生物科技有限公司，批號為39012-20-9）；細胞裂解液（碧云天生物技術研究所，批號為P0013）；SOD測試盒（批號為A001），GSH-Px測試盒（批號為A005），CAT測試盒（批號為A007），均為上海滬峰生物科技有限公司產品。

1.2 方法

動物模型制備：動物置實驗室適應環境1周，自由進食、飲水；室溫（23±2）℃，自然光照。隨機抽取5只作為假手術組，其余30只分離并結扎雙側頸總動脈建立前腦缺血模型［9］。術前動物禁食12 h，經10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰臥固定、無菌操作，假手術組不結扎頸總動脈，其余操作同試驗組。術后2 h仍未蘇醒或死亡的9只動物剔除，將成功的21只動物模型再隨機分為模型組5只和治療組16只。

干預措施：將治療組16只動物按照L16（45）正交試驗設計分組，詳見表1。治療時間窗為因素A，設缺血1.0，1.5，2.0，2.5 h 4個水平，分別為因素A1，A2，A3，A4；治療劑量為因素B，設5，10，20，40 mg/kg體重4個水平，分別為因素B1，B2，B3，B4。將胡黃連苷Ⅱ應用0.9%氯化鈉注射液溶解稀釋成1%溶液，按照L16（45）正交表設計，在相應的缺血時間，腹腔注射相應劑量胡黃連苷Ⅱ。假手術組和模型組術后2.0 h腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。

表1 L16（45）正交試驗設計表

標本采集：大鼠給藥24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，開胸經心臟取血4 mL，以4 000 r/min的速率離心10 min，分離血清，-20℃保存。

指標檢測：應用黃嘌呤氧化酶法、化學比色法和光化學法分別測定血清勻漿超SOD，GSH-Px和CAT的活性。取血清勻漿室溫解凍，離心取上清液100 μL，按試劑盒說明書操作，蒸餾水調零，紫外分光光度計（BeckmannDU640，USA）在波長550 nm（SOD），412 nm（GSH-Px）和405 nm（CAT）處測定各管的吸光度值，計算血清勻漿中SOD，GSH-Px和CAT的活性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析。通過方差分析和t檢驗，根據不同水平的缺血（給藥）時間和劑量，及給藥時間和劑量的交互作用對檢測指標是否有顯著性影響，得出最佳的劑量和時間窗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 指標檢測結果

造模后，動物血清中SOD，GSH-Px和CAT的活性較假手術組均顯著降低（t=12.31～43.85，P＜0.01）；治療后，動物血清SOD，GSH-Px和CAT的活性較模型組均明顯升高（t=3.87～12.75，P＜0.01），詳見表2。治療組動物血清SOD，GSH-Px和CAT的活性檢測結果見表3。

表2 3組動物SOD，GSH-Px和CAT檢測結果（±s，U/mL）

表2 3組動物SOD，GSH-Px和CAT檢測結果（±s，U/mL）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別假手術組（n=5）模型組（n=5）治療組（n=16）SOD 92.50±6.44 62.42±4.72*82.22±7.69#GSH-Px 328.14±9.84 267.13±8.31*305.80±25.04#CAT 11.51±1.57 7.81±0.99*9.22±2.64#

表3 L16（45）正交試驗設計與結果（U/mL）

2.2 方差分析

SOD活性：因素A和因素B的不同水平對腦缺血后血清SOD活性的影響比較，差異有統計學意義（P＜0.01），而時間-劑量交互作用顯示因素C對其無顯著性影響（P＞0.05），詳見表4。說明不同水平的缺血時間即治療時間窗和給藥劑量對腦缺血后血清SOD活性均有顯著性影響，而給藥時間與給藥劑量的交互作用對血清SOD活性無明顯影響（P＞0.05）。應用最小顯著差數法（LSD）對各組數據進行兩兩比較，結果顯示，血清SOD的活性在給藥（缺血）時間1.5 h（A2）與2.5 h（A4），2.0 h（A3）與2.5 h（A4）間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其余給藥時間兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥劑量5 mg（B1）與20 mg（B2），20 mg（B3）與40 mg（B4）比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其余給藥劑量兩兩比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。從治療時間窗最大化和用藥劑量最小化的角度考慮，以A2B3組合最佳，即最佳治療時間窗和治療劑量為腦缺血1.5 h、腹腔注射20 mg/kg。

表4 SOD活性方差分析

GSH-Px活性：不同水平的缺血時間和給藥劑量對血清GSH-Px活性的影響比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而時間-劑量的交互作用可忽略不計（P＞0.05），詳見表5。LSD兩兩比較顯示，血清GSH-Px的活性在給藥（缺血）時間1.0 h（A1）與2 h（A3），1.5 h（A2）與2.0 h（A3）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），其余給藥時間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；給藥劑量5 mg（B1）與40 mg（B4），10 mg（B2）與20 mg（B3）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），其余給藥劑量兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。從治療時間窗最大化和用藥劑量最小化角度考慮，以A2B2最佳，即最佳治療時間窗和劑量分別為腦缺血1.5 h和腹腔注射10 mg/kg。

表5 GSH-Px活性方差分析

CAT活性：不同水平的缺血時間對血清CAT活性均有明顯影響（P＜0.01），而給藥劑量和時間-劑量交互作用對其無顯著性影響（P＞0.05），詳見表6。LSD兩兩比較顯示，血清CAT活性在給藥（缺血）時間1.0 h（A1）與2.0 h（A3）間比較，差異無統計學意義（P＞0.05），其余給藥時間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；給藥劑量5 mg（B1）與20 mg（B3），10 mg（B2）與40 mg（B4），20 mg（B3）與40 mg（B4）比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其余給藥劑量兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。根據治療時間窗最大化和給藥劑量最小化原則，以A2B3最佳，即最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5 h和腹腔注射20 mg/kg。

表6 CAT活性方差分析

3 討論

醫學研究表明，有些中藥的有效成分如紅景天苷、銀杏內酯、毛蕊異黃酮、大黃酚等能有效改善腦缺血損傷后動物的神經功能、縮小腦梗死體積，減輕腦組織病理改變［10-12］。以劑量依賴的方式降低丙二醛（MDA），H2O2和蛋白羥基合物含量，增強SOD，CAT和GSH-Px的活性，具有抗氧化和抗細胞凋亡作用［13］。細胞培養發現，胡黃連苷Ⅱ對H2O2導致的PC12神經細胞［4-5］損傷有明顯保護作用。動物試驗表明，腦缺血-再灌注損傷后，胡黃連苷Ⅱ可能通過抑制細胞凋亡和調節iNOS及SOD的表達，改善模型大鼠神經行為功能［14］。

本試驗以腦缺血大鼠血清中SOD，GSH-Px和CAT的活性為檢測指標，L16（45）正交試驗結果表明，不同水平的給藥時間和用藥劑量對胡黃連苷Ⅱ的治療效果差異有統計學意義（P＜0.05），且根據不同的檢測指標分析其最佳組合結果也不盡一致。從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B3，A2B2和A3B3組合較好，即胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5～2.0 h和腹腔注射10～20 mg/kg。

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Preliminary Study on the Treatment of Rats with Cerebral Ischemia Injury in Dose and Time Window of PicrosideⅡ

Yu Chunhua1，Song Meng1，Qu Xiancheng1，Wang Lili1，Wang Yuan2
（1.Central Hospital of Qingdao，Qingdao，Shandong，China266000；2.Department of Pharmacy，The Ninth Hospital of Qingdao，Qingdao，Shandong，China266000）

ObjectiveTo study the optimal dose and time window of Picroside II in treating cerebral ischemia injury in rats.Methods The bilateral common carotid arteryligation（BCCAO）was used to establish the model of forebrain ischemia in rats，the orthogonal experiment design was used to divide the groups.The rats were given intraperitoneal injection of PicrosideⅡ.The serum superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and catalase（CAT）activity was detect by the application of xanthine oxidase，chemical colorimetry and photochemical method.ResultsAccording to the analysis of serum SOD，GSH-Px and CAT activity in cerebral ischemia，the optimal effect of PicrosideⅡin treating cerebral ischemic injury was by intraperitoneal injection of 1.5 h 20 mg/kg，1.5 h/10（mg·kg）and 1.5 h/20（mg·kg）.ConclusionThe optimal dose and time window of PicrosideⅡin treating cerebral ischemia is by intraperitoneal injection of 1.5-2.0 h and 10-20 mg/kg.

PicrosideⅡ；cerebral ischemia；dose；time window；SOD；GSH-Px；CAT；rat

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）20-0062-03

于春華（1963-），女，漢族，大學本科，副主任藥師，研究方向為心腦血管疾病，（電子信箱）0532meng@sina.com；王遠，女，漢族，大學本科，副主任藥師，研究方向為心腦血管疾病，本文通訊作者，（電話）0532-84961730。

2015-03-30）