SDE-GC-MS法重現性及普洱茶發酵香氣變化研究

王利妍，郭天杰，石興云，蔣 賓，念 波，焦文文，王旭東，趙 明，馬 燕

(云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】普洱茶(Pu-erh tea)是以云南大葉種茶樹曬青毛茶為原料，經固態發酵(后發酵)等工序加工而成的茶葉產品[1]。陳香顯著是普洱茶的重要品質特征，也是決定其價格的重要條件[2]。基于對品質的重要影響以及獨特的香氣類型，普洱茶香氣物質分析得到了學者的廣泛關注。【前人研究進展】已有學者分別對普洱茶香氣物質組成[3]和微生物[4]對普洱茶香氣成分影響等進行了研究。發現普洱茶香氣重要特征在于發酵過程中形成了大量的1，2，3-三甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯等顯陳香的甲氧基苯化合物[5]。已有研究采用同時蒸餾萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)、頂空固相微萃取 (Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME) 、減壓蒸餾萃取 (Vaccum distillation extract，VDE)和超聲波輔助萃取分散液液微萃取 (Ultrasound-assisted extraction-Dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，UAE-DLLME)等方法提取普洱茶香氣物質。【本研究切入點】可能由于分析成本較高，呂才有[3]、曹艷妮[1,6]、趙苗苗[7]、Xu X[8]、Gong Z[9]等應用同時蒸餾萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)只進行一次提取分析；李建勛[10]、陳保[11]、張靈枝[12]等應用頂空固相微萃取法(Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME)也只進行了一次提取分析；僅發現葉靜[4]、徐詠全[13]、張文杰[14]和Lv H[15]等人進行了重復提取，其他研究只進行了1次分析或未明確標示，較少關注重現性(Reproducibility )。重現性是評判一個試驗數據可信度的重要參數。由于在密閉系統以較高溫度萃取時次生反應劇烈[3]，同時蒸餾萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)的重現性尤其值得關注。然而已有應用同時蒸餾萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)結合氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)對普洱茶香氣物質的研究，未進行重復實驗，因此有必要從重現性的角度考察評價該方法的準確性。【擬解決的關鍵問題】應用同時蒸餾萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)結合氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)檢測了2次普洱茶發酵的原料(曬青毛茶)和出堆樣的香氣物質組成，并從物質鑒定重復率(定性)及峰面積精密度(定量)考察該方法的重現性，同時利用電子鼻分析香氣變化并進行感官審評，以期為準確認識普洱茶香氣形成提供科學知識。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗材料 某茶廠2次普洱茶發酵的原料樣品(R1、R2)和出堆樣品(P1、P2)。

1.1.2 試驗設備及試劑 美國Agilent 7890A-5975C GC-MS 氣質聯用儀；電子鼻(PEN3) ，北京盈盛恒泰科技有限責任公司；SDE同時蒸餾萃取設備；瑞士BUCHI R-3旋轉蒸發儀。二氯甲烷、無水硫酸鈉,均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 同時蒸餾萃取法 準確稱取茶樣100.0 g，將供試茶樣置于同時蒸餾萃取設備內，用二氯甲烷50 mL提取5 h。萃取液用無水硫酸鈉干燥、過濾，萃取液用旋轉蒸發儀揮干溶劑，揮發油進行稱量。用二氯甲烷將揮發油溶解至1.00 mL，用GC-MS進行檢測，每個樣品提取檢測重復3次。

1.2.2 氣相色譜-質譜聯用技術(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS) 色譜條件為色譜柱：HP7890A-5975C(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持2 min，以4 ℃/min升溫至250 ℃，保持20 min；載體：氦氣(He)，進樣量為2 μl；采分流比為25∶1。

質譜條件為電子能量70 ev；氣質接口溫度為280 ℃；離子源溫度為230 ℃；電離方程：EI,倍增器電壓為1894 v。

根據GC-MS分析得到的各色譜峰，通過檢索譜庫(NIST11.L)，結合相對保留時間，查閱有關文獻數據進行香氣物質鑒定，根據香氣物質的峰面積值相對定量。

1.2.3 電子鼻與感官審評 電子鼻測定香氣方法依照使用說明進行，儀器設置測定時間60 s，取響應信號區間48～51 s進行數據分析。感官審評根據國家標準GB/T23776-2009中茶葉審評方法及對茶樣進行感官審評。

1.3 數據處理

應用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/構建VN圖，比較物質鑒定重復率，重復率為3次均鑒定的化合物數量/至少1次鑒定到的化合物數量。使用IBM SPSS Statistics及Winmuster軟件進行主成分(PCA)分析，HemI軟件進行熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 重現性分析

在某茶廠收集了2次普洱茶發酵的原料樣品與出堆樣品，通過SDE-GC-MS法分別提取檢測3次。GC-MS共鑒定出210個化合物，R1、P1、R2、P2的物質鑒定重復率在50.78 %～71.30 %。以R1為例，一共鑒定到的化合物有122個，3次重復都鑒定到的化合物有65個，鑒定到2次的化合物有24個，33個化合物僅鑒定到1次(圖1)。以3次都鑒定到的化合物峰面積計算RSD，R1、P1、R2、P2的RSD分別為0.85～52.08 %、1.76 %～70.91 %、1.5 %～67.04 %和0.76 %～7 0.01 %。RSD在0～5 %的化合物有4～14個，在5 %～10 %的化合物有8～22個(圖2)。

2.2 樣品香氣物質組成特征與變化

以4個樣品3次重復均檢測到的化合物峰面積為指標進行PCA分析，得到累積變量為92.31 %的三維PCA圖(圖3)。為了驗證GC-MS結果，進一步進行電子鼻測定，提取傳感器響應信號進行PCA分析，得到累積變量為99.83 %的PCA圖(圖4)。2次PCA分析，各樣品的分布相符。都是R1和R2相聚較近成為1簇，P1和P2聚成不同的簇。說明經過發酵香氣物質組成發生顯著變化，且該廠2次發酵出堆樣品的香氣存在差異。

圖1 重復鑒定化合物的VN圖比較Fig.1 VN diagrams of compounds identified in replicated tests

圖2 重復鑒定化合物的峰面積RSD分布Fig.2 RSD of peak areas of compounds identified in replicated tests

本研究一共鑒定到210個化合物，其中3次重復均檢測到的有118個，后續以此118個化合物進行分析。從化合物類別看，主要包括醇類、酮類、酯類、醛類等(圖5)。原料樣以醇類化合物為主，R1、R2相對含量分別為53.3 %和50.0 %，主要包括芳樟醇及其氧化產物、植物醇及α-松油醇等物質；其次是酯類化合物，R1、R2的相對含量分別為14.8 %和12.2 %，主要有二氫獼猴桃內酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯等物質。出堆樣品以雜氧化合物為主，P1、P2相對含量分別為44.0 %和41.5 %，包括1，2，3-甲氧基苯、3，4，5-三甲氧基甲苯及1，2，4-三甲氧基甲苯等；其次是醇類化合物，相對含量分別為24.7 %(P1)和25.7 %(P2)，主要包括芳樟醇氧化物(反式吡喃型)反式芳樟醇氧化物(呋喃) 順式芳樟醇氧化物(呋喃)等物質。

圖3 基于峰面積的PCA分析Fig.3 PCA analysis of peak area

圖4 基于電子鼻提取數據的PCA分析Fig.4 PCA analysis of data of electronic nose

對118個化合物峰面積進行熱圖分析(圖6)，發酵前后芳樟醇、鄰苯二甲酸二異丁酯等68個物質含量降低，1，2，3-三甲氧基苯及1，2，3，4-四甲氧基苯等50個物質含量增加。其中僅在原料中鑒定到香葉醇、2，6-二甲基環己醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、二十六烷等32個物質，僅在出堆樣品中鑒定到2，6-二甲氧基苯酚、亞油酸、1，2，3，4-四甲氧基苯、庚烯醛等25個化合物。

2.3 感官審評

發酵原料與出堆樣品感官審評如表1所示,R1湯色黃明亮，滋味醇正回甘，R2湯色橙黃，滋味濃醇回甘，香氣均清香持久；經過發酵，出堆樣品湯色轉變為紅褐(圖7)，滋味變為醇和或平和，香氣以陳香為主。發酵原料與出堆樣品差異顯著。該結果與GC-MS和電子鼻分析相符，都表明經過發酵，茶葉內含物質成分及含量發生劇烈變化，從而導致原料與出堆樣品在色、香、味等方面的顯著差異。

圖5 香氣物質類別的相對含量Fig.5 Relative content of classification of aroma substances

圖6 鑒定物質峰面積的熱圖Fig.6 Heat map of peak area of identified compounds

表1 茶樣感官審評結果

圖7 茶樣審評圖Fig.7 Photography of sensory evaluation of tea leaves

3 討 論

3.1 SDE-GC-MS重現性

經測定分析，4組樣品的物質鑒定重復率為50.78 %～71.30 %，RSD在0.85 %～70.91 %。徐詠全[13]和張文杰[14]利用HS-SPME鑒定化合物的RSD 均小于10 %，谷勛剛[16]應用SDE重復6次RSD 均小于12 %。本文章峰面積的RSD與已有結果差距較大，推測SDE提取中次生反應劇烈，香氣成分發生變化。李艷清[17]等研究發現SDE存在長時間高溫致物質轉化，提取效率低且不能按比例提取，因此該方法得到的精油與實際香氣有一定的差距。李建勛[18]研究表明，HS-SPME優于SDE方法用于普洱茶香氣物質提取。這些結論與本文章基本一致，表明SDE-GC-MS分析茶葉香氣物質時需要增加重復或改進提取方法。但是呂世懂等人[19]發現，不同香氣提取方法均存在一定缺陷，今后有待開發靈敏度更高、次生反應更小的方法，研究茶葉香氣物質。

3.2 發酵前后香氣物質組成與變化

經分析發現，原料樣品以醇類和酯類化合物等為主，出堆樣品以雜氧和醇類化合物等為主。曹艷妮[6]研究表明，熟茶主要的香氣化合物為芳樟醇吡喃氧化物及α-松油醇等物質。趙苗苗[7]發現，曬青毛茶香氣物質以醇類及烯烴類物質為主。本文章結果與呂海鵬[20]及等研究的普洱茶香氣以甲氧基苯類化合物，醛酮類和醇類為主基本一致。

通過熱圖分析，經過發酵芳樟醇等68個物質含量降低，1，2，3-三甲氧基苯等50個物質含量增加。張靈枝[12]發現在發酵過程中，醇類和碳氫化合物劇烈減少，酯類和雜氧類化合物成分顯著增加。曹艷妮[6]結果表明，α-松油醇、香葉醇及芳樟醇等經過發酵顯著下降。其中僅在原料樣品中鑒定到香葉醇等32個物質，僅在出堆樣品中鑒定到1，2，3，4-四甲氧基苯等25個化合物。與曹艷妮[6]等發現熟茶中獨有的1，2，3，4-四甲氧基苯的結論相似。Xu[8]與Gong[9]等發現在發酵過程中，醇類和碳氫化合物劇烈減少，酯類和雜氧類化合物成分顯著增加。這些變化規律與以上研究結果近似，即普洱茶發酵過程，醇酯類物質顯著減少，甲氧基苯等雜環化合物顯著增加。推測這些化合物在發酵過程中或提取過程中發生了降解、轉化或新生成，可能與普洱茶發酵過程中劇烈的氧化有關。

4 結 論

本文章研究發現SDE-GC-MS法測定茶葉香氣物質的重現性較低，建議增加重復實驗次數，或改換提取方法。本文章共檢測到118個化合物，從香氣物質類別來看，普洱茶發酵原料以醇類為主，發酵后樣品甲氧基苯等雜氧化合物相對含量較高；峰面積比較發現，發酵中芳樟醇、植物醇及香葉醇等68個物質含量降低，1，2，3-三甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯及1，2，3，4-四甲氧基苯等50個物質含量增加。總之，發酵中醇類物質減少，甲氧基苯等雜氧化合物含量增加，進而形成了普洱茶陳香顯著的特征。