白藜蘆醇對碘海醇所致糖尿病大鼠腎損傷的作用及其機制

龐天舒，王巖 ，左中夫，任克 ，劉學政

（1. 錦州醫科大學附屬遼河油田總醫院疾病預防控制科，遼寧 盤錦 124010； 2. 錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室，遼寧 錦州 121000；3. 中國醫科大學附屬第一醫院放射科，沈陽 110001）

對比劑腎病是因對比劑而導致的急性腎功能衰竭，有研究［1-2］發現低滲透型對比劑碘海醇，因高含碘量在體內以原形由腎小球濾過而不被腎小管吸收，脫水時該藥在腎內濃度增高，可致腎損害而發生急性腎衰竭。糖尿病是對比劑腎病的危險因素之一，糖尿病患者發生對比劑腎病的概率高達50%［3］。沉默接合型信息調節因子2同源蛋白-1（silent mating type information regulation 2 homolog-1，SIRT1） 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰酶，在細胞的分化、增殖、凋亡、衰老、抵抗炎癥、延長細胞存活時間等方面都發揮著重要的作用［4-9］。近年來發現，SIRT1唯一激動劑——白藜蘆醇 （resveratrol，Res） 可以抑制細胞凋亡，改善糖尿病腎病大鼠腎功能損傷［10］，但其具體機制有待證實。低氧誘導因子-1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在嚴重缺氧條件下或缺氧的早期階段，HIF-1與P53相互作用，誘導凋亡，有研究［11］發現，SIRT1可以通過調控HIF-1的表達影響凋亡。本研究探討Res對碘海醇所致糖尿病大鼠腎損傷的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級糖尿病大鼠45只，雄性，體質量250～300 g，購自北京維通利華公司［生產許可證號：SCXK（京） 2012003］。采用隨機數字法分為3組：假手術組（Sham組，n = 15）、碘海醇組 （NL組，n = 15） 和Res組（n = 15）。

1.2 模型制備

采用文獻［12］對比劑腎損傷模型建立方法，Res組大鼠給予Res （100 mg/kg） 灌胃，NL組及Sham組給予等量生理鹽水，連續給藥5 d，第6天大鼠禁食水，第7天大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，剝離股靜脈，穿刺股靜脈，NL組及Rse組先后注射吲哚美辛 （10 mg/kg）、左旋硝基精氨酸甲酯 （10 mg/kg）、碘海醇 （3 g/kg），每次給藥間隔15 min，Sham組同時間注射等量生理鹽水，待大鼠平穩后，逐層縫合。

1.3 樣品采集

模型建立48 h后過量麻醉處死大鼠，經下腔靜脈取血 （5 mL），部分送檢驗科檢測血清肌酐 （serum creatinine，Scr） 和血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN），另一部分低溫冰箱保存用于ELISA檢測，然后于腹主動脈注入大量冷凍生理鹽水，直至流出清亮液體，剝離腎臟，于PBS緩沖液中剔除腎臟周圍脂肪及其他組織，一部分于甲醛中固定用于HE染色及TUNEL檢測，另一部分錫紙包裹于-80 ℃冰箱保存，用于Western blotting及qRT-PCR檢測。

1.4 HE染色

取多聚甲醛中固定的腎臟組織，流水沖洗1 h，濾紙浸干，分別置于70%、80%、90%、100%乙醇中，二甲苯中20 min，浸蠟中3 h，包埋機包埋，切片機切片，厚度4～6 μ m，將切片放入37 ℃烤箱中過夜，再分別2次放入二甲苯中進行脫蠟處理，完成脫蠟的切片放入濃度遞減的梯度乙醇中脫水，之后進行蘇木素染色5 min，酸化水反藍，伊紅染1 min，分別浸80%、90%、95%、100%乙醇1 min，二甲苯5 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5 ELISA 檢測

為觀察Res對碘海醇導致的糖尿病腎病大鼠氧化應激及腎功能影響，采用ELISA試劑盒 （武漢USCN公司） 檢測大鼠總超氧化物歧化酶 （total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 和谷胱甘肽過氧化物酶 （glutathione，GPX） 的含量，具體操作步驟參照說明書進行，空白孔加樣品稀釋液 （100 μ L），余孔分別加標準品或待測樣品 （100 μ L），37 ℃孵育2 h；棄去液體，甩干，每個孔中加入Detection Ab工作液 （100 μ L），37 ℃溫育1 h；棄去孔內液體，洗板 3次；每孔加HRP Conjugate工作液（ 100 μ L），37 ℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干；每孔加底物溶液（ 100 μ L），37 ℃避光孵育15 min左右；每孔加終止液（ 50 μ L）終止反應，酶標儀在450 nm波長測量各孔光密度（ optical density，OD）。

1.6 TUNEL檢測

切片，常規脫蠟，水化，3%H2O2甲醇溶液，室溫下30 min，封閉過氧化物酶，洗滌；滴加蛋白酶K工作液，37 ℃孵育，恢復至室溫，洗滌； 0.1%TritonX-100，1%枸鹽酸鈉溶液，恢復室溫，洗滌；滴加反應混合物，37 ℃孵育90 min，洗滌，正常山羊血清封閉，室溫20 min，棄去血清，滴轉化POD溶液，37 ℃孵育30 min，恢復室溫，洗滌。光鏡下陽性細胞核染色為棕黃色，水洗終止反應。

1.7 Western blotting檢測

將腎臟組織加入RIPA細胞裂解緩沖液中電動勻漿器均漿、離心后聚氰基丙烯酸正丁酯 （bicinchoninic acid，BCA） 蛋白定量試劑盒 （南京凱基生物公司） 對蛋白進行定量后進行電泳，轉膜，過夜。加入SIRT1 （ab110304）、HIF-1 α （ab187524） 抗體，4 ℃孵育過夜，再將其與過氧化物酶標記的羊抗兔IgG室溫下反應，室溫孵育2 h后將膜與增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL） 反應后曝光顯色，結果使用Image Tools （Irbis Technologies） 進行吸光度分析，實驗結果以相應蛋白條帶的OD比值來表示。

1.8 qRT-PCR檢測

將收集的組織充分研磨，加入Trizol （美國Invitrogen公司，15596026） 溶液中，按照Trizol試劑操作說明書分離提取組織和細胞中的總RNA，反轉錄合成第一鏈cDNA后，按照qRT-PCR法檢測SIRT1、HIF-1 α反應，參照試劑盒操作說明書配制，引物序列：SIRT1，上游引物，5’-CAGCATTGCCCAGAAGAA -3’；下 游 引 物 ，5’-CGTGGAGGACAGTGTAGGTG -3’。HIF-1α，上游引物，5’-TGCTGCTACTGCTCTG -3’；下游引物，5’-TGGAGTGAGGACGAAC-3’。β-actin，上游引物，5’-CATCTACGAGGGCTACGC -3’，下游引物，5’-TCTCCTTGATGTCCCGCA-3’。由上海生工生物公司進行合成。反應條件為預變性95 ℃ 30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環40次； 融解曲線分析95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反應結束后確認擴增曲線和融解曲線。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟病理學結果

模型建立48 h后，HE染色觀察腎臟病理學變化。結果顯示，Sham組大鼠腎小管上皮細胞排列規則，腎小管結構正常；NL組大鼠腎小管空泡變性，細胞脫落至小管腔，腎小管結構破壞，提示碘海醇可以導致糖尿病大鼠腎臟形態學改變，建模成功。Res組僅見少量腎小管細胞空泡變性，部分細胞脫落至小管腔，腎小管結構基本正常，提示Res可以改善碘海醇導致的糖尿病大鼠腎功能損傷，見圖1。

2.2 各組大鼠血清總Scr和BUN比較

圖1 各組大鼠腎臟病理學HE染色結果×200Fig.1 HE staining of renal tissue in each group ×200

進一步檢測大鼠血清總Scr和BUN情況，結果顯示，建模48 h后，與Sham組比較，NL組大鼠血清總Scr、BUN含量明顯升高 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠血清總Scr、BUN含量明顯降低 （均P ＜ 0.05），與病理學結果一致，提示碘海醇可以誘導糖尿病大鼠腎功能損傷，Res可以改善碘海醇誘導的糖尿病腎損傷。見表1。

2.3 各組大鼠 T-SOD、MDA和GPX含量比較

表1 各組大鼠血清BUN和Scr含量比較Tab.1 Comparison of plasma BUN and Scr levels in each group

ELISA法檢測結果顯示，建模48 h后與Sham組比較，NL組大鼠血清中MDA含量顯著升高，而T-SOD和GPX顯著降低 （均P ＜ 0.05），提示碘海醇可以通過促進氧化應激誘導糖尿病大鼠腎損傷。與NL組比較，Res組大鼠血清中T-SOD和GPX含量顯著升高 （均P ＜ 0.05），MDA顯著降低 （P ＜ 0.05），提示Res可以通過抑制氧化應激改善碘海醇誘導的糖尿病大鼠腎損傷，見表2。

2.4 TUNEL檢測結果比較

Res對碘海醇誘導糖尿病大鼠腎損傷的影響通過TUNEL檢測顯示，與Sham組比較，NL組大鼠腎小管上皮細胞凋亡明顯。與NL組比較，Res組僅見少量腎小管上皮細胞凋亡。提示Res可以抑制腎小管上皮細胞凋亡，減輕腎功能損傷。 見圖2。

表2 各組大鼠血清中T-SOD、GPX和MDA含量比較Tab.2 Comparison of serum T-SOD，GPX，and MDA levels in each group

2.5 各組大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表達比較

圖2 各組大鼠TUNEL結果 ×200Fig.2 TUNEL results of each group of rats ×200

為觀察Res對碘海醇誘導對比劑腎損傷大鼠SIRT1、HIF-1 α蛋白表達的影響，采用Western blotting檢測SIRT1、HIF-1 α蛋白表達，結果顯示，與Sham組比較，NL組大鼠HIF-1 α表達明顯是升高，而SIRT1表達明顯降低 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠SIRT1表達明顯升高，而HIF-1 α明顯降低 （P ＜0.05）。見圖3、表3。

2.6 各組大鼠SIRT1、HIF-1α mRNA 表達比較 （表3）

圖3 Western blotting檢測腎組織中SIRT1和HIF-1 α蛋白表達水平Fig.3 SIRT1 and HIF-1 α protein expression in the renal tissue of rats detected by Western blotting

表3 各組大鼠腎組織中SIRT1和HIF-1 α蛋白、mRNA表達水平Tab.3 SIRT1 and HIF-1 α protein and mRNA expression in the renal tissue of rats

qRT-PCR檢測SIRT1和HIF-1α mRNA水平，結果顯示，與Sham組比較，NL組大鼠HIF-1α mRNA表達明顯是升高，而SIRT1 mRNA表達明顯降低 （P ＜ 0.05）；與NL組比較，Res組大鼠SIRT1 mRNA表達明顯升高，而HIF-1α mRNA明顯降低 （P ＜ 0.05），與Western blotting結果一致，提示Res可以通過調控SIRT1、HIF-1 α蛋白表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，改善碘海醇所致的糖尿病大鼠腎損傷。

3 討論

本研究利用碘海醇建立糖尿病大鼠腎損傷模型，采用HE染色、 ELISA、 Western blotting、 qRT-PCR等技術，觀察Res對大鼠腎小管損傷、凋亡、氧化應激及SIRT1和HIF-1 α蛋白表達影響，結果發現Res可以減輕碘海醇導致的大鼠腎小管上皮細胞損傷，抗氧化應激，抑制細胞凋亡，此外還發現Res可以上調碘海醇誘導糖尿病腎損傷大鼠腎臟組織中SIRT1蛋白表達，而使HIF-1 α蛋白表達顯著降低，提示Res可以減輕碘海醇誘導的糖尿病大鼠腎功能損傷，其機制可能與調控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達，抑制細胞凋亡有關。

研究［13-14］表明，對比劑腎病已成為含碘對比劑注射之后的嚴重并發癥之一，僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物，成為引起醫院獲得性腎衰竭的常見原因，約占醫源性急性腎功能衰竭的10%。糖尿病是對比劑腎病的危險因素之一，其發生機制尚不清楚，可能與腎臟血流動力學改變、腎臟低氧、低灌注、氧化應激、炎癥、細胞損傷、對比劑造成的腎小管直接毒性作用等多種因素相關［15］。目前普遍認為對比劑對腎小管供氧平衡的破壞是損傷發生和發展的主要機制之一。正常情況下，人體存在氧自由基的產生和清除，SOD主要反映自由基造成的細胞傷害［16］，GPX能有效清除生物體內的自由基［17］，MDA反映過氧化物損傷程度［18］，本研究利用對比劑碘海醇誘導糖尿病腎損傷大鼠模型，發現建模48 h后，大鼠腎小管上皮細胞損傷，凋亡，細胞脫落至腎小管腔，腎小管結構破壞，血清總Scr、BUN、MDA均升高，T-SOD、GPX降低，提示碘海醇可以導致糖尿病大鼠腎功能損傷及腎小管上皮細胞凋亡，其機制可能與氧化應激有關。

Res具有調節血脂水平、防止低密度脂蛋白氧化、抗血小板凝集、抗腫瘤、抗氧化及抗自由基的作用［19］，近年來Res在腎臟疾病中廣泛應用，JEFREMOV等［20］研究發現Res可以有效清除金屬誘導基團和超氧化物，對活性氧 （reactive oxygen species，ROS）引起的DNA損傷具有保護作用。PALSAMY等［21］研究發現Res可以通過抗氧化應激、抑制細胞凋亡對糖尿病腎病大鼠腎功能產生保護作用，但目前對于Res對對比劑腎病預防和治療機制尚未清楚，本研究利用Res干預碘海醇誘導糖尿病腎損傷大鼠，結果發現，Res可以減輕碘海醇引起的糖尿病大鼠腎小管損傷及凋亡，抑制其氧化應激反應，對碘海醇誘導的糖尿病大鼠腎損傷具有保護作用，其機制可能與抑制氧化應激有關。

SIRT1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰酶，在細胞的分化、增殖、凋亡等方面發揮著重要的作用［22］，HIF-1是具有轉錄活性的核蛋白，是與缺氧適應、炎癥發展及腫瘤生長等作用相關的靶基因，與SIRT1關系密切［23］，研究發現SIRT1可以通過調控HIF-1 α影響細胞凋亡，而關于缺氧組織內HIF-1誘導或抑制細胞凋亡的機制，有研究［24］認為與Bcl-2和P53等基因有關，P53是凋亡相關基因，而Bcl-2 具有抑制凋亡作用。本研究發現，建模48 h后，SIRT1表達明顯降低，而HIF-1 α表達明顯升高，提示碘海醇誘導糖尿病大鼠腎損傷可能與調控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達、促進腎小管上皮細胞凋亡有關，而Res可能通過調控SIRT1及HIF-1 α蛋白表達來抑制碘海醇誘導的糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡。其機制可能與調控SIRT-1及HIF-1 α蛋白表達有關。