利用同位素標記相對和絕對定量技術篩查神經管畸形胚胎孕鼠血清差異蛋白質譜

安東，袁正偉

（中國醫科大學 1. 附屬第一醫院兒科，沈陽 110001；2. 附屬盛京醫院衛生部小兒先天畸形重點實驗室，沈陽 110004）

神經管畸形 （ neural tube defects，NTDs） 是兒童常見的畸形，發病率為1‰～5‰［1］。 70%～80% 的NTDs可能通過產前篩查手段如超聲及孕婦血清甲胎蛋白 （alpha fetoprotein，AFP） 篩查出來，但目前AFP等產前檢查標記物的特異性并不高［2-3］。孕期胎兒和孕婦之間存在相互交換，其交換物質包括細胞內、細胞外因子［4-5］。血清蛋白譜變化能夠反應孕婦和胎兒的生理和病理變化。因此，研究孕婦血清蛋白譜變化規律對畸形的早期發現和研究畸形的發生機制具有十分重要的意義。

近年來，蛋白質組學研究對疾病的早期診斷、發病機制探討有重要意義［6］。本課題組已用蛋白質組學方法對先天性顯性脊柱裂 （spina bifida aperta，SBA） 胎鼠的脊髓組織及羊水進行了蛋白質表達譜的分析，結果發現了新的特異性的差異表達蛋白［7-8］。本研究采用同位素標記相對和絕對定量 （isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ） 技術［9］，利用維甲酸致畸動物模型，研究比較SBA致畸早期孕11、13 d （E11、E13） 與正常孕鼠血清蛋白表達譜的變化，以篩選出多種與NTDs相關的差異表達蛋白，為尋找NTDs早期血清蛋白標志物及探討發病機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象

成熟未孕Wistar大鼠 （體質量250～300 g） 由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供，雌雄比例5∶1午夜合籠，晨8:00陰道涂片鏡下見到精子記為孕0 d （E0）。將孕10 d （E10） 孕鼠隨機分為2組，致畸組以維甲酸混懸液 （140 mg/kg） 經胃管灌飼，對照組給予同體積的橄欖油。孕鼠分別于E11、E13行水合氯醛腹腔麻醉，心臟穿刺取血，剖宮取出胎鼠，解剖顯微鏡下辨認胎鼠是否為BA。血標本用無抗凝劑的5 mL 普通采血試管，室溫放置2 h，使血液凝固析出血清，3 000 g離心20 min，冰上分裝于1.5 mL的EP 管中，每管200 μ L，-80 ℃保存。iTRAQ實驗分組為維甲酸致畸組 （E11、E13）和正常對照組 （E11、E13），每組5例血清預混。本研究符合中國醫科大學實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質提取與濃度測定：將致畸組和對照組各組內5個樣本等體積混合為一個樣本，用Proteo miner試劑盒去除血清高豐度蛋白，使用Brandford方法進行蛋白濃度測量。

1.2.2 iTRAQ標記、SCX 分離與液相串聯質譜分析：每個樣品取出蛋白100 μ g，胰蛋白酶酶解消化，按照操作手冊進行iTRAQ標記。E11正常對照組 （E11N），標記114標簽；E11維甲酸致畸組 （E11SBA），標記117標簽；E13正常對照組 （E13N），標記118標簽；E13維甲酸致畸組 （E13SBA），標記121標簽。室溫培養2 h，標記后的各組肽段混合。采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4.6 mm×250 mm 型號的Ultremex SCX柱對樣品進行液相分離，分離后組分經Triple TOF 5600 的液相色譜電離串聯質譜 （LC-ESI-MSMS） 分析采集數據。

1.3 質譜數據分析及生物信息學分析

應用Mascot檢索軟件，選擇數據庫Uniprot_RAT（ 34908sequences）進行數據庫搜索，對蛋白質進行鑒定。根據蛋白質豐度水平，當差異倍數＞1.5，且經統計檢驗其P ＜ 0.05 時，視為致畸組與正常對照組之間的表達差異蛋白。對鑒定出的差異蛋白，通過檢索Gene Ontology數據庫和COG數據庫，進行GO生物學功能富集分析和COG功能分類分析。

2 結果

2.1 鑒定得到差異蛋白

本研究共得到譜圖157 422 張，通過Mascot 軟件進行分析后，匹配到的譜圖數量7 303張，其中Unique 譜圖數量為6 013張，共鑒定到2 167個肽段，其中含1 880個Unique 肽段和390個蛋白。對E11、E13維甲酸致畸組與正常對照組差異蛋白（ 表1）、E11與E13正常對照組差異蛋白、E11與E13維甲酸致畸組差異蛋白4組資料進行兩兩比較，共發現顯著差異表達的152 個蛋白（圖1）。在這些有差異表達的蛋白中，維甲酸致畸組與正常對照組比較，蛋白APOM和PCSK9 在E11和E13同時下調，蛋白FGG和Uncharacterized在E11和E13同時上調，蛋白PLA-2g2a、FGl2、SERPINE2、TUBB5、FGl1和HP在E11下調而在E13上調，見圖2。

表1 E11、E13維甲酸致畸組與正常對照組差異蛋白Tab.1 Differentially expressed proteins in sera of rats harboring SBA fetuses and normal controls at E11 and E13

（續表）

（續表）

圖1 各比較組間差異蛋白數量統計Fig.1 Comparison between the differentially expressed serum proteins in pregnant rats with SBA fetuses and normal controls at E11 and E13

圖2 差異蛋白表達交集圖Fig.2 Differentially expressed serum proteins

2.2 生物信息學分析

2.2.1 GO注釋：對差異蛋白質進行GO 分析，發現其主要參與的生物學功能包括細胞進程 （9.30%）、單有機體過程 （9.30%）、應激反應 （8.25%）、生物功能調節 （7.89%）、發育過程 （4.91%）和信號轉導 （4.39%），見圖3。

2.2.2 COG注釋：COG 注釋，差異蛋白主要參與蛋白質翻譯后修飾、折疊、分子伴侶和細胞骨架功能，見圖4。

3 討論

目前，比較蛋白質組學應用于出生缺陷研究，在尋找產前診斷標記物、探索胚胎畸形發生機制和治療靶點等方面已做了大量研究。iTRAQ 技術是先進的定量比較蛋白質組學方法之一，優點有定量敏感、標記完全、標記效率高。在本研究中，采用iTRAQ 相關技術對脊柱裂動物模型致畸早期的孕鼠血清總蛋白進行鑒定和比較蛋白組學相對定量分析，共鑒定了390個蛋白，其中152 個蛋白在不同組間出現顯著差異表達。結果表明，將iTRAQ 標記串聯質譜技術用于NTDs孕鼠血清的比較蛋白組學分析是一種行之有效的方法。

維甲酸致畸組與正常對照組相比，E11鑒定差異表達的蛋白為40 個，遠遠多于E13鑒定差異表達的蛋白26 個，說明致畸早期有更多的蛋白分子參與異常神經發育過程。在這些差異蛋白中，部分蛋白曾在NTDs、神經疾病、胚胎發育畸形的蛋白質組學研究中報道。如應用雙向電泳和質譜分析技術，對正常對照組和維甲酸致畸組孕17 d胎鼠脊髓組織的蛋白質組進行分析，發現了差異蛋白14-3-3ε蛋白、蛋白二硫化物異構酶 （protein disulphide-isomerase，PDI ） 家族［8］；在唐氏綜合征孕婦血清中篩查出標志物富組氨酸糖蛋白 （ histidine-richglycoprotein） 和維生素D 結合蛋白 （ vitamin D-binding protein）［10-11］；臍血中發現新生兒特異蛋白Transgelin-2［12］；阿爾茲海默病腦脊液篩查出基質Gla-protein 前體和結合珠蛋白前體；帕金森病腦脊液篩查出載脂蛋白M和維生素D結合蛋白前體［13］。提示iTRAQ 標記技術用于蛋白質相對定量的比較研究有可比性和延續性。用iTRAQ 標記技術對致畸早期E11、E13維甲酸致畸孕鼠血清進行相對定量分析，共鑒定出38 個在畸形組中表達顯著上調的蛋白和28 個表達顯著下調的蛋白。這些致畸早期差異蛋白可能參與NTDs的發生過程，有望作為NTDs產前診斷的標志物。

圖3 GO分類圖 （參與生物學功能）Fig.3 Gene ontology annotation based on biological functions

圖4 COG 分類圖Fig.4 COG annotation

在血清學中鑒定到的差異蛋白，從其GO 分類可知這些蛋白質參與細胞進程、應激反應、生物功能調節、發育過程、信號轉導等諸多方面的生物過程。所鑒定的差異蛋白中，部分是功能已知與畸形明確相關的分子，如14-3-3ε蛋白和PDI。14-3-3ε是哺乳動物神經系統正常發育所必需的一種蛋白質，該蛋白缺失或缺陷時，會發生腦死亡或嚴重大腦畸形［14］。PDI 蛋白具有蛋白質轉錄后修飾、協助蛋白質折疊、裝配、運輸功能，進而抑制細胞凋亡、保護細胞、減少應激對器官造成的傷害等多種作用［15-16］。此外，還有很多新發現的蛋白，其中部分蛋白參與胚胎的正常發育。對這些蛋白進行進一步的驗證分析和深入的體內外實驗和功能驗證研究，將有助于闡明這些蛋白參與和調控脊柱裂發生機制的方式，為NTDs產前診斷與新的靶向治療打下基礎。