依達拉奉對癲癇持續狀態大鼠神經元凋亡及XIAP、Caspase—3表達的影響

齊登斌 郭振元 閆波 張蕊

[摘要] 目的 探討自由基清除劑依達拉奉對于大鼠癲癇持續狀態后所導致的神經元凋亡和XIAP、Caspase-3的影響。方法 對2015年9月—2017年9月雄性Wistar大鼠共54只展開研究，將該組所有大鼠隨機分為對照組（N組）、模型組（M組）和依達拉奉組（ED組）3組，其中對照組6只，后兩組再分為6、12、24、48 h 4個亞組，每個亞組6只。采用氯化鋰-匹羅卡品制備SE動物模型，大鼠海馬神經元凋亡檢測采用TUNEL法來完成，同時對XIAP、Caspase-3蛋白表達采用免疫組化來進行檢測。結果 在6 h內SE后M組主要有陽性TUNEL、XIAP和Caspase-3細胞，TUNEL和Caspase-3表達高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表達高峰在12 h（40.68±2.817），兩組差異有統計學意義（P=0.013）。ED組與M組相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3陽性細胞數減少（P<0.05），XIAP陽性細胞數有所增加（P<0.05）。結論 依達拉奉在大鼠神經元凋亡下持續癲癇狀態中應用，可以提高XIAP蛋白的表達，抑制Caspase-3蛋白的表達，從而對神經元損傷提供保護。

[關鍵詞] 依達拉奉；大鼠；癲癇持續狀態；XIAP；Caspase-3

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2019）01（c）-0023-03

Effects of Edaravone on Neuronal Apoptosis and Expression of XIAP and Caspase-3 in Rats with Status Epilepticus

QI Deng-bin1， GUO Zhen-yuan1， YAN Bo2， ZHANG Rui3

1.Department of Neurology， Yanzhou District People's Hospital， Jining Medical College， Jining Medical College， Jining， Shandong Province， 272200 China；2.Shandong Sino-US Translational Medicine Cooperation Research Center， Jining， Shandong Province， 272200 China； 3.Affiliated Hospital of Jining Medical College （Pediatrics Department），Jining， Shandong Province， 272200 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of free radical scavenger edaravone on neuronal apoptosis and XIAP and Caspase-3 induced by epilepticus in rats. Methods A total of 54 male Wistar rats from September 2015 to September 2017 were enrolled. All rats in this group were randomly divided into control group （N group）， model group （M group） and edaravone group （ED group）， there were three groups， including 6 in the control group. The latter two groups were subdivided into four subgroups of 6 h， 12 h， 24 h and 48 h， with 6 in each subgroup. The animal model of SE was prepared by using lithium chloride-pilocarpine. The apoptosis of rat hippocampal neurons was detected by TUNEL method. The expression of XIAP and Caspase-3 protein was detected by immunohistochemistry. Results After 6 hours， the main group had positive TUNEL， XIAP and Caspase-3 cells peak expression of TUNEL and Caspase-3 was about 24 h （43.17±1.424），（35.26±1.428）； the peak of XIAP expression was 12 h （40.68±2.817）， the different was statistically significant（P=0.013）. Compared with the M group， the number of TUNEL and Caspase-3 positive cells decreased in the ED group at 12 h， 24 h and 48 h （P<0.05）， and the number of XIAP positive cells increased （P<0.05）. Conclusion The application of edaravone in the continuous epilepsy state of rat neuronal apoptosis can increase the expression of XIAP protein and inhibit the expression of Caspase-3 protein， thus providing protection for neuronal damage.

[Key words] Edaravone； Rat； Status epilepticus； XIAP； Caspase-3

癲癇持續狀態在臨床醫學中是一種常見的急癥，會導致認知狀態及行為狀態發生急性或是持續性改變，從而導致大腦皮質、海馬體等邊緣神經元損傷。細胞凋亡的過程是一種程序性和自主性的過程，主要是受到基因調控，同時也是SE后神經元死亡重要形式之一。目前在抗凋亡效應中Caspase-3、XIAP對SE中的病理生理機制目前仍缺乏深入的研究。依達拉奉作為一種新型自由基清除劑，對遲發性神經細胞死亡及脂質過氧化反應具有抑制作用，該組對2015年9月—2017年9月54只大鼠癲癇持續狀態治療中采用依達拉奉，并對患鼠癲癇持續狀態后神經元損傷情況，和對其自由基影響加以觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

取健康成年雄性Wistar大鼠54只，體質量為190～230 g，該組實驗材料由濟寧醫學院附屬醫院實驗動物中心提供，氯化鋰、匹魯卡品、依達拉奉由美國Sigma公司所提供。SOD試劑盒選購于南京建成生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 對該次的研究對象按照雙盲法將其分為對照組（n=6）和實驗組（n=48），其中實驗組又分為依達拉奉治療組（ED組）與模型組（M組），后兩組再分為6、12、24、48 h 4個亞組，每個亞組6只。

1.2.2 動物模型建立 該組研究中所有動物均采用灌胃法，在造模前一刻鐘ED組向腹腔注射50 mg/kg，依達拉奉（國藥準字H20160151），M組與N組注射50 mg/kg，生理鹽水。在造模后ED組與M組根據體質量指數注射127 mg/kg氯化鋰，在20 h后向腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品（國藥準字H20013262）。對照組大鼠采用適量生理鹽水向腹腔注射，觀察大鼠在15～30 min后的癲癇發作狀態，并給予地西泮（國藥準字H33020250），終止癲癇發作。

1.2.3 標本處理方法 對各個時間點大鼠的狀態進行觀察，在給予1%的戊巴比妥鈉麻醉后，在冰盤上取腦，將大鼠腦干和小腦快速去除，并將其置于0～4℃的生理鹽水中進行漂洗，去除殘留血液，并用濾紙進行擦拭干凈，并取左側稱其質量，加入適量生理鹽水，在冰浴中采用玻璃勻漿器制成腦勻漿，取上清液將其放置到冰箱中儲藏，等待測定。右側半腦采用多聚甲醛固定1 d，在石蠟包埋后，對其海馬部位做一矢狀切片，并對其采用免疫組織化學法對蛋白表達進行測定。

1.2.4 染色 按照試劑盒說明方法對 TUNEL進行染色，陽性細胞即凋亡細胞，將細胞核染為棕黃色顆粒。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫組化檢測 采用常規法進行免疫組化檢測，每張切片取5個（×400倍）視野，測定各個視野陽性細胞數量，并取平均值進行計算。

1.3 統計方法

采用SPSS 13.6統計學軟件對該組數據加以評定與總結，用χ2檢驗對計數資料進行檢驗，多樣本均數用方差表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察

N組大鼠在治療后無癲癇持續發作狀態，采用匹魯卡品向M組大鼠注射，待半小時后，大鼠均出現不同的癥狀，如點頭、咀嚼等，部分大鼠出現站立、前肢痙攣等，同時會導致全身出現強直陣攣，上述癥狀反復發作，產生癲癇持續狀態。ED組癲癇發作程度較輕，潛伏期長。

2.2 HE染色結果

正常對照組大鼠細胞呈橢圓形或圓形，核仁清晰，神經元排列整齊，胞漿透明，染色質分布均勻；模型組細胞排列紊亂，胞核固縮，胞漿紅染，有嗜酸性神經元。依達拉奉組的嗜酸性神經元數量少，細胞排列較為松散，形態趨于正常。

2.3 細胞凋亡檢測 N組大鼠陽性細胞表達較少

6 h時，M組大鼠SE后有TUNEL表達，主要分布在海馬CA3區，陽性細胞核染色呈棕黃色，TUNEL陽性細胞表達少量，著色淺，隨著時間的延長而不斷增加，在24 h時達到表達高峰，在48 h時減少。ED組與M組兩組在凋亡陽性細胞數變化上無顯著差異，在24 h時TUNEL陽性細胞表達處于高峰，但細胞數量較M組少（P<0.05）。見表1。

2.4 XIAP及Caspase-3免疫組化結果

在12、24 h和48 h，ED組與M組XIAP和Caspase-3表達差異有統計學意義。見表2、3。

3 討論

癲癇主要是由于多種因素所引起的一種慢性神經系統疾病綜合征，由于大腦神經元異常，從而引起重復和短暫的神經功能失調，在癲病發展中自由基發揮著重要作用，根據研究發現，在癲癇時自由基是腦內異常代謝產物，并參與到癲病發展，加重腦損傷，損傷到線粒體，導致腦內神經元凋亡、興奮性神經遞質合成，進而產生疾病，在腦組織中具有較高的脂質含量，同時自由基會攻擊腦內的不飽和脂肪酸，脂質會產生過氧化反應，產生大量過氧化物，同時又被分解成MDA產物，從而產生細胞代謝障礙，或導致腦實質功能產生障礙。在動物研究實驗中發現，在癲癇發病中腦內MDA含量增加，下丘腦、腦垂體、海馬體和腦皮層SOD活性降低，而癲癇發作次數的增加，這種變化也會隨之發生顯著變化。據研究觀察與分析發行，大鼠癲癇持續狀態下產生神經元凋亡，是由于有多種調控基因參與其中，受到基因調控所導致，而Caspase與XIAP則是當前在對凋亡調控基因中研究較多。

XIAP對Caspase分子起到直接結合及抑制的作用，抑制對由Fas及線粒體所介導的凋亡，具有內源性凋亡抑制作用[3-4]。在本組實驗中發現，N組有Caspase和XIAP基礎量表達，6h內SE后M組主要有陽性TUNEL、XIAP和Caspase-3細胞，TUNEL和Caspase-3表達高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表達高峰在12 h（40.68±2.817）。ED組與M組相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3陽性細胞數減少，XIAP陽性細胞數增加，（P<0.05）。依達拉奉通過提高XIAP蛋白的表達，抑制Caspase-3蛋白的表達，從而發揮保護神經元作用[5-6]。翟紅等人[7]在研究中采用氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇持續狀態模型，對50只大鼠在癲癇持續狀態后腦內自由基活動情況進行觀察，研究發現，在SE后，模型組腦組織勻漿中SOD活性下降，下降程度超過之前的25%，MDA含量增加，增加程度超過之前數據的50%。并且參與研究的兩組大鼠TUNEL和Caspase-3表達高峰在24 h左右為（45±0.5）、（35±1.5）；并且XIAP表達高峰在12 h左右的數據為（40±1.5）；其選擇的另一組TUNEL和Caspase-3陽性細胞數量也相對減少，為之前數據的85%左右，并且XIAP陽性細胞數開始增加，與本組研究結果較為相似。

依達拉奉（edravone，EP）作為全新的自由基清除劑，其能夠通過對脂質過氧化作用進行抑制、抑制腦細胞所產生的過氧化作用，并且還能夠讓神經元死亡時間得到延遲，減輕不明原因誘發的人體組織或者腦水腫損傷現象[7-8]。研究表明EP可對多種炎癥介質具有調節作用，同時HMGBl、TNF-α及IL-6中還具有抗炎介質作用，因此依達拉奉對SE后大腦的保護機制是多途徑、多位點的，筆者將做進一步探討。

[參考文獻]

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[8] 張志英. 癲癇損傷機制的探討及依達拉奉對海人酸致癇大鼠海馬神經元的保護作用[D].石家莊：河北醫科大學，2015.

（收稿日期：2018-10-28）