黃芪水提物對慢性腎功能衰竭模型大鼠的改善作用及其對MAPK信號通路的影響Δ

汪衛紅，許燁，李志明，遠方

（遼寧中醫藥大學附屬醫院腎內科，沈陽110032）

慢性腎功能衰竭（CRF）是由各種原發性或繼發性腎臟疾病導致的腎功能不可逆性減退，甚至功能喪失，其中代謝產物潴留、電解質紊亂、酸堿平衡失調及內分泌異常等是各種腎臟疾病終末階段的共同表現[1-2］。臨床上主要采用透析、腎移植或相應的對癥治療（如靜脈輸注5%碳酸氫鈉溶液糾正酸中毒、重組促人紅細胞生成素糾正貧血或骨化三醇治療腎性骨病等）等以緩解CRF癥狀，但上述治療方案不良反應均較嚴重，且無法從本質上阻止CRF的進展[3］。大量研究表明，中醫藥療法可改善腎功能并延緩CRF的進展，對CRF的治療具有重要意義[4-6］。黃芪為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］或膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.］的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血等功效[7］。黃芪的主要成分為黃芪甲苷、黃芪多糖及多種類黃酮類化合物。現代藥理研究表明，黃芪及其水提物具有抗氧化、抗凋亡等作用，可改善CRF并調節糖尿病腎病模型大鼠的腎功能，但其作用機制尚未見深入探討[8-9］。有研究指出，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路相關調控蛋白p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細胞外調節蛋白激酶（ERK）在CRF模型大鼠體內的磷酸化程度明顯增高，且可加重其氧化應激及炎癥反應，促進細胞凋亡[10］，但黃芪對CRF模型大鼠的MAPK信號通路是否具有調節作用尚未見相關報道。為此，本研究通過建立CRF大鼠模型，探討黃芪水提物對其氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡以及MAPK信號通路的影響，以期為黃芪的臨床應用提供實驗及理論依據。

1 材料

1.1 儀器

RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司）；BS-180型全自動生化分析儀、MR-96A型酶標儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；UV-5600型紫外-可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；7500型實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）儀（美國ABI公司）；Mini-Sub Cell GT Cell型水平核酸電泳儀、Trans-Blot SD型半干式蛋白轉膜儀、ChemiDoc MP型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；5810R型離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

黃芪飲片購自安徽亳州藥材市場（批號:170926），經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為豆科植物蒙古黃 芪[A.membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao］的干燥根。

貝那普利原料藥（陽性對照，批號:Y0001025，純度:＞98%）、腺嘌呤（批號:A8626）均購自美國Sigma公司；血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20170409、20170418、20170511、A001-1-1、A007-1-1、A003-1）；白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒和全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號分別為KGERC007、KGEMC003、KGERC102a、KGP2100）；小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin，內參）、磷酸化p38 MAPK（pp38 MAPK）、ERK1/2、磷酸化JNK（p-JNK）抗體以及兔抗人p38 MAPK、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號分別為3700、9216、4696、9255、8690、4377、9258）；辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗小鼠IgG二抗、HRP標記羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為bs-0368R、bs-0295G）；RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒、TrizolTM試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為K1682、108304）；TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，批號:AQ131-02）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、免疫印跡發光（ECL）試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號分別為P0009、P0018S）；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液（北京索萊寶科技有限公司，批號:T1085）；蛋白上樣緩沖液（大連美侖生物技術有限公司，批號:MA0003）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質量200～250 g，購于遼寧長生生物有限公司[動物生產許可證號:SCXK（遼）2015-0001］。所有動物均分籠飼養，室溫維持在20～25℃，濕度為50%，每日光照12 h。

2 方法

2.1 黃芪水提物的制備

稱取黃芪飲片500 g，粉碎，浸泡過夜后，分別用10倍量（g/L）水煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，得浸膏53.4 g（得率為10.68%）。將上述浸膏用水溶解，得質量濃度為1 g/mL（按生藥量計）的黃芪水提物，置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有大鼠均適應性飼養1周后，隨機分為對照組（10只）和造模組（50只）。對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水；造模組大鼠均參照文獻[11-12］方法建立CRF模型:即灌胃25%腺嘌呤混懸液（以水為溶劑）200 mg/kg，每天1次，連續28 d。造模后，將造模組大鼠隨機分為模型組、貝那普利組（2 mg/kg；以水為溶劑；劑量設置參考文獻[13］）以及黃芪水提物低、中、高劑量組（1.5、3、6 g/kg，按生藥量計；以水為溶劑；劑量按臨床成人劑量的3、6、12倍換算而得），每組10只。對照組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，各給藥組大鼠均灌胃相應藥物；每天1次，連續28 d[13］。

2.3 樣品的采集

末次給藥12 h后，處死各組大鼠，于腹主動脈采血，10 000 r/min離心10 min，分離血清，于－20℃保存，備用。剝離各組大鼠的腎臟，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗，剔除周圍脂肪組織，用錫紙包裹后，于－80℃冰箱中保存，備用。

2.4 血清腎功能指標及炎癥因子的檢測

采用比色法以全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清Scr、BUN、UA含量，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 氧化應激相關指標的檢測

稱取各組大鼠腎組織200 mg，加生理鹽水適量，制成勻漿，10 000 r/min離心5 min，取上清液作為待測樣品，分別采用羥胺法、可見分光光度法及硫代巴比妥酸法（TBA）以紫外-可見分光光度計檢測各組大鼠腎組織中SOD、CAT活性和MDA水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.6 凋亡相關因子mRNA表達的檢測

采用Real-time PCR法檢測。采用Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA 100 mg，加入TrizolTM試劑1 mL，反復吹打，按第1鏈cDNA合成試劑盒說明書反轉錄得cDNA。以所得cDNA為模板，參照TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進行擴增，各待測基因引物由北京賽諾科為生物科技有限公司設計、合成（引物序列見表1）。反應體系（共20 μL）:cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，2×Top Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環30次；72℃再延伸1 min。以β-actin作為內參，采用2－ΔΔCt法計算各基因的相對表達量（Ct表示目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環數），本研究以Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量的比值（Bax/Bcl-2）及Caspase-3 mRNA的相對表達量作為量化指標。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

2.7 MAPK信號通路相關調控蛋白表達的檢測

采用Western blotting法檢測。將各組大鼠腎組織剪碎，按全蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，于4℃下以12 000 r/min離心20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，加入蛋白上樣緩沖液以體積比1∶1進行稀釋，于100℃下變性10 min，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用TBST溶液清洗，分別加入p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、β-actin一抗（加入量均為1∶1 000），于4℃下孵育過夜，用TBST溶液清洗3次，每次5 min，隨后加入相應二抗[β-actin、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-JNK:HRP標記兔抗小鼠IgG二抗，p38 MAPK、p-ERK1/2、JNK:HRP標記羊抗兔IgG二抗；加入量均為1∶1 000］，室溫孵育1 h后，用TBST溶液清洗，以ECL顯色后，使用凝膠成像系統成像，采用Image J 1.8.0軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以相應蛋白與內參條帶的灰度值比值來表示該蛋白的相對表達量。

2.8 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 黃芪水提物對CRF模型大鼠血清腎功能指標含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清上述腎功能指標含量均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 各組大鼠血清中Scr、BUN、UA含量比較（x±s，n＝10）Tab 2 Comparison of serum contents of Scr，BUN and UAin rats of each group（x±s，n＝10）

3.2 黃芪水提物對CRF模型大鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述炎癥因子水平均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（x±s，n＝10，ng/L）Tab 3 Comparison of serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rats of each group（x±s，n＝10，ng/L）

3.3 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中氧化應激相關指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著提高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，貝那普利組及黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著下降，且貝那普利組MDA含量顯著低于黃芪水提物高劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余給藥組上述指標組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 各組大鼠腎組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較（x±s，n＝10）Tab 4 Comparison of SOD and CAT activities，MDA contents in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

3.4 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中凋亡相關因子mRNA表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達量均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2以及貝那普利組和黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3 mRNA的相對表達量均顯著降低，且貝那普利組Bax/Bcl-2顯著低于黃芪水提物高劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而其余給藥組上述指標組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表5。

3.5 黃芪水提物對CRF模型大鼠腎組織中MAPK信號通路相關調控蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達量均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；而各給藥組其余指標組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見圖1、表6。

表5 各組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2和Caspase-3 mRNA相對表達量比較（x±s，n＝10）Tab 5 Comparison of Bax/Bcl-2 and mRNA related expression of Caspase-3 in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

圖1 各組大鼠腎組織中MAPK信號通路相關調控蛋白表達的電泳圖Fig 1 Electrophoregrams of the expression of MAPK signaling pathway-related regulatory proteins in renal tissue of rats in each group

表6 各組大鼠腎組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達水平比較（x±s，n＝10）Tab 6 Comparison of the expression of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK and p-JNK in renal tissue of rats in each group（x±s，n＝10）

4 討論

CRF是各種慢性腎臟疾病所致腎功能惡化的結局之一，其主要生理表現為腎小球濾過率降低，腎小球和腎小管遭到破壞，從而導致機體代謝產物（如Scr、BUN等）聚集，最終進展為尿毒癥[14］。目前主要的治療方案無法從根本上解決腎組織的損傷，且費用較高、副作用明顯，患者極其痛苦[15］。因此，探索治療CRF的新途徑、新藥物顯得尤為重要。CRF屬中醫“關格”“腎勞”“溺毒”“水腫”“癃閉”等范疇，其病因病機皆與脾腎有關，脾腎兩虛易致濁毒內蘊[16］。《素問·通評虛實論》曰:“邪氣盛則實，精氣奪則虛”，表明CRF屬“本虛標實”之證。黃芪是中醫治療CRF必不可少的一味藥材，其味甘、性微溫，歸脾肺經。《珍珠囊》曰:“黃芪甘溫純陽，其用有五:補諸虛不足，一也；益元氣，二也；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，內托陰疽，為瘡家圣藥，五也”。《本草匯言》贊其為“補肺健脾，實衛斂汗，驅風運毒之藥也”。可見，黃芪具補中益氣之力強之意，為治療CRF之要藥[17］。血管緊張素轉換酶抑制劑貝那普利是臨床治療CRF的主要藥物，可減少患者蛋白尿，并改善其腎功能[18］，故本研究將其作為陽性對照藥物。

Scr是肌肉在人體內代謝的產物，主要由腎小球濾過排出體外，腎功能不全時，Scr在體內蓄積使得其含量有所升高；BUN是血漿中除蛋白質以外的一種含氮化合物，其經腎小球濾過而排出體外，當腎功能不全失代償時，BUN含量將升高；UA為嘌呤代謝的終產物，在腎功能減退時，血中UA含量將升高[19-20］。由此可見，Scr、BUN、UA是臨床上反映患者腎功能損傷的重要指標。本研究考察了黃芪水提物對CRF模型大鼠血清Scr、BUN、UA含量的影響。結果顯示，模型組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均較對照組顯著升高；經不同劑量黃芪水提物處理后，各給藥組大鼠血清Scr、BUN、UA含量均較模型組顯著降低。這提示黃芪水提物可提高CRF模型大鼠的腎小球濾過率，加快Scr、BUN、UA等代謝產物的排出。

血清炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達水平是反映機體炎癥反應的常用指標[21］。IL-1β可參與炎癥反應后期纖維化的形成過程，并可促進內皮細胞和巨噬細胞中蛋白激酶的活性，加重腎臟損傷；IL-6是與腎小球疾病關系最為密切的炎癥因子，主要由巨噬細胞、單核細胞、T細胞等分泌；TNF-α由巨噬細胞分泌，可損傷腎小管內皮細胞，刺激成纖維細胞增殖，從而加快了腎纖維化的形成[22］。本研究采用ELISA法檢測了各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。結果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組顯著升高。這提示CRF可引發較為嚴重的炎癥反應，與文獻結果[21］基本一致。經不同劑量黃芪水提物處理后，各給藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較模型組顯著降低。這提示黃芪水提物可有效抑制CRF模型大鼠的炎癥反應。

現代醫學研究指出，除炎癥反應外，氧化應激和細胞凋亡在CRF的發病機制中亦扮演了重要的角色[23-24］。CRF患者體內抗氧化酶活性的降低可導致其機體內氧自由基無法被及時清除，使得氧自由基過剩，進而加重氧化應激反應[15］。其中，SOD是反映氧化應激狀態的重要指標，CAT能有效清除生物體內的自由基，兩者是減輕氧化應激損傷的主要屏障；MDA能客觀反映過氧化物致損傷的嚴重程度[25］。本研究對各組大鼠腎組織中氧化應激相關指標進行了考察。結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著提高。經不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，貝那普利組及黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中SOD、CAT活性均顯著升高，MDA含量均顯著下降，且貝那普利組MDA含量顯著低于黃芪水提物高劑量組。這提示黃芪水提物可抑制CRF模型大鼠腎組織中的氧化應激反應，但作用可能弱于陽性對照藥物。

細胞凋亡是細胞內在的一種程序性死亡，是維持機體細胞間平衡的關鍵因素，也是CRF發生的重要機制之一[23-24］。在凋亡發生過程中，Bcl-2與Bax以二聚體形式存在，當Bcl-2表達多時抑制細胞凋亡，而當Bax表達多時則促進細胞凋亡[26］。Caspase-3是凋亡效應蛋白酶，在細胞凋亡過程中表達量有所增加，并誘導激活下游的Caspase效應分子，從而啟動凋亡的發生[27］。本研究采用Real-time PCR法檢測了各組大鼠腎組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相對表達量。結果顯示，模型組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2及Caspase-3 mRNA的相對表達量均較對照組顯著升高。這提示CRF可導致大鼠腎組織促凋亡因子Bax、Caspase-3的表達增加，而使抑凋亡因子Bcl-2的表達降低，與文獻結果[28］基本一致。經不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Bax/Bcl-2以及貝那普利組和黃芪水提物中、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3 mRNA的相對表達量均顯著降低，且貝那普利組Bax/Bcl-2顯著低于黃芪水提物高劑量組。這提示黃芪水提物可通過調控Bax、Bcl-2、Caspase-3等凋亡相關因子mRNA的表達來降低CRF模型大鼠腎組織的細胞凋亡水平，但這種作用可能弱于陽性對照藥物。

MAPK級聯反應是胞內信號轉導的重要途徑，廣泛存在于真核細胞內，參與調節細胞生長、氧化應激、炎癥反應和細胞調亡等過程[29］。在MAPK家族成員中，最早得以證實的是ERK轉導途徑，其是MAPK信號轉導的經典通路，能調控腎小管上皮細胞間充質轉分化，抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，能夠改善腎小管上皮細胞間充質轉分化而減輕腎纖維化程度[30］。除ERK1/2之外，MAPK家族還包括p38 MAPK、JNK兩個成員。其中，p38 MAPK作為MAPK信號通路中的一員，是控制炎癥反應的主要因子，在應激條件下參與細胞凋亡、免疫調節及炎癥反應過程。有研究表明，p38 MAPK與氧化應激程度及腎纖維化進展密切相關[31］。JNK家族是MAPK信號通路成員，可被炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）、氧化損傷等多種因素激活，JNK信號通路在細胞凋亡、氧化應激反應以及多種人類疾病的發生與發展過程中起著至關重要的作用[32］。為探討黃芪水提物抗CRF作用與MAPK信號通路的相關性，本研究采用Western blotting法檢測了MAPK信號通路中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK蛋白的表達情況。結果顯示，模型組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達量均較對照組顯著升高。經不同劑量黃芪水提物處理后，與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白的相對表達量均顯著降低。這提示黃芪水提取可通過抑制p38 MAPK、ERK1/2及JNK蛋白的磷酸化來抑制MAPK信號通路，從而緩解CRF的進展。

綜上所述，黃芪水提物對CRF模型大鼠具有一定的改善作用，可抑制其炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡，其作用機制可能與抑制MAPK信號通路相關調控蛋白的表達有關。本研究雖初步探討了黃芪水提物治療CRF模型大鼠的可能機制，為黃芪用以CRF的臨床治療提供了理論和實驗依據，但并未闡明其發揮作用的主要活性單體。本課題組后續將深入探討其活性單體，并進一步闡明其具體作用機制。