阿托伐他汀誘導EPC-MVs增多對STEMI患者心肌細胞的保護作用研究Δ

林蕓蕓，黃珊，宋艷玲，顧申紅#

（1.海南醫學院第一附屬醫院全科醫學科，海口570102；2.海南醫學院第一附屬醫院心內科，海口 570102）

缺血性心血管疾病是世界范圍內患者死亡的首要原因，急性心肌缺血性損傷可導致患者冠狀動脈長期供血不足，從而致使其心肌細胞發生不可逆轉的損傷[1］。有研究指出，急性心肌梗死患者常常合并內皮祖細胞（EPCs）減少及功能下降[2］。EPCs是一類在血液系統中循環并能分化為血管內皮細胞的前體細胞，其數量減少是血管內皮功能紊亂的獨立危險因素[3］。相關研究表明，阿托伐他汀可升高冠心病患者體內高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，后者是EPCs數量和功能的重要決定因素[3-4］。同時，由EPCs分泌的微囊泡（MVs）可抑制心肌細胞肥大和凋亡，并促進受損心肌細胞恢復[4-5］。近年來有研究證實，內皮祖細胞微囊泡（EPC-MVs）可介導重要的生物學調控功能（如血管的修復與再生、相關細胞內皮化等），而人源微RNA-126（hsa-miR-126）作為EPCs特異性表達的一種促血管內皮新生的微RNA（miRNA），極有可能參與了上述生物學調控的過程[6］。本研究通過觀察阿托伐他汀對ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者EPCs數目以及MVs分泌功能的影響，以期為進一步明確他汀類藥物的作用機制，為急性心肌缺血性損傷的防治提供有效治療策略。

1 資料與方法

1.1 納入、排除與脫落標準

納入標準:（1）依據《2012年歐洲心臟病學會ST段抬高的急性心肌梗死管理指南》的診斷標準[7］確診為STEMI；（2）年齡 45～75歲；（3）從未使用過他汀類藥物。

排除標準:（1）惡性腫瘤患者；（2）嚴重的內科疾病患者；（3）嚴重的肝、腎、肺功能不全者；（4）慢性傳染性疾病患者；（5）精神疾病患者；（6）存在藥物過敏史者；（7）服藥依從性差者；（8）孕產婦；（9）出現肌酸磷酸激酶升高（＞7.5 U/dL）并伴有肌炎者[8］。

脫落標準:（1）失去聯系無法獲得長期隨訪信息者；（2）不配合隨訪調查，語言表達不明確者；（3）死亡者。

本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過后，所有受試者均知曉本研究的內容及目的，并簽署了知情同意書，嚴格遵照同意書精神進行本項研究。

1.2 研究對象

選取2015年2月－2018年2月我院心內科收治的STEMI患者182例，按照所服用阿托伐他汀的劑量分為A組（88例）和B組（94例）。

其中，A組中男性50例，女性38例；年齡52～75歲，平均（61.3±8.1）歲；有吸煙史者39例（占44.32%）；高血壓18例（占20.45%），高脂血癥31例（占35.22%），糖尿病12例（占13.64%），糖尿病合并高血壓18例（占20.45%），糖尿病合并高脂血癥5例（占5.68%），高血壓合并糖尿病3例（占3.41%），高血壓合并糖尿病、高脂血癥者1例（占1.14%）。B組中男性53例，女性41例；年齡50～75歲，平均（61.3±8.1）歲；有吸煙史者38例（占40.43%）；高血壓18例（占19.15%），高脂血癥28例（占29.79%），糖尿病20例（占21.28%），糖尿病合并高血壓21例（占22.34%），高血壓合并糖尿病與高脂血癥者7例（占7.45%）。兩組患者上述一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。此外，經冠狀動脈造影分析，兩組患者的冠狀動脈血管病變數目、病變位置及病變類型等比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1（同一患者可能存在多處病變或多種病變類型，故其合計值＞患者總數）。

表1 兩組患者冠狀動脈病變情況比較[例（%%）］Tab 1 Comparison of coronary artery lesion between 2 groups[case（%%）］

1.3 治療方法

兩組患者均接受經皮冠狀動脈介入治療（PCI），術后予注射用比伐蘆定[江蘇豪森藥業集團有限公司，批準文號:國藥準字H20140057，規格:0.25 g（按C98H138N24O33計）］0.75 mg/kg，靜脈注射，隨后以1.75 mg/（kg·h）靜脈滴注至術后6 h，同時口服硫酸氫氯吡格雷片（法國Sanofi Clir SNC公司，注冊證號:國藥準字J20130083，規格:75 mg），維持劑量為75 mg/d，每日1次+阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批準文號:國藥準字H20051408，規格:20 mg）行抗血小板治療。其中，A組患者口服20 mg，每日1次；B組患者口服20 mg，每日2次。30 d為1個療程，兩組患者均連續治療至少3個療程。

1.4 考察指標

1.4.1 血脂水平的檢測 分別于治療前及治療后第30、60、90天自前臂靜脈抽取兩組患者的外周靜脈血2 mL，采用化學抽提法以VITROS 5600型全自動生化分析儀及配套試劑盒（美國Johnson&Johnson公司）檢測血液中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、HDLC的水平。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

1.4.2 EPCs的檢測 分別于治療后第30、60天，自前臂靜脈抽取兩組患者的外周靜脈血20 mL，置于含3.8%肝素鈉的真空采血管中，于4℃下以1 600 r/min離心30 min，分離外周血單核細胞。將上述單核細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，于4℃下孵育30 min后，在避光條件下分別加入藻紅蛋白（PE）標記的山羊抗小鼠CD133、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的山羊抗兔CD34單克隆抗體（德國Miltenyi Biotec Macs公司，加入量均為1∶800），于4℃、2%多聚甲醛溶液中孵育30 min，用PBS清洗，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用PBS 400 μL重懸后，采用EPICS?XL-MCLTM流式細胞分析儀（美國BD公司）檢測，并記錄EPCs陽性細胞計數（CD133、CD34雙染色即為EPCs陽性細胞）。

1.4.3 EPC-MVs的提取及其miRNA表達譜的檢測 于治療后第60天，取“1.4.2”項下EPCs約1×106個，加至含0.5%胎牛血清白蛋白（BSA）的RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）中，于37℃、5%CO2條件下培養24 h后，于4℃下以2 500 r/min離心20 min，收集上清液，繼續于4℃下以10 000 r/min離心1 h，棄去上清液，沉淀用含25 mmo/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（pH 7.3）的Medium 199培養基（美國Gibco公司）進行重懸，于4℃下以10 000 r/min離心1 h，沉淀用PBS 100 μL重懸，于－80℃冰箱中保存，備用。采用Affymetrix microRNA 3.0 Array基因芯片檢測兩組患者經阿托伐他汀治療后外周血EPC-MVs miRNA的表達譜。該試驗操作及結果判定均由上海其明信息技術有限公司完成。

1.4.4 差異miRNA表達的驗證 根據“1.4.3”項下表達譜的檢測結果，選擇5個差異較大（兩組患者每個特異性芯片富集miRNA的reads數的差異倍數大于1為“上調”，其值越大，差異越明顯；差異倍數小于1為“下調”，其值越小，差異越明顯）的基因，采用熒光定量聚合酶鏈反應技術（qRT-PCR）對其miRNA表達進行驗證。取“1.4.2”項下EPCs約1×106個，采用Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）并參照其說明書方法提取細胞總RNA，采用miRNA首鏈cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司）并參照其說明書逆轉錄得miRNA，以U6為內參，采用qRT-PCR法檢測miRNA的表達量。反應體系及條件參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（日本Takara公司）說明書，采用2－ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量（Ct表示每個樣品的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數）[9］。上述試驗均重復3次。

1.4.5 差異表達最明顯的miRNA靶基因分析 通過StarBase在線數據庫（http://starbase.sysu.edu.cn/）檢索差異表達最明顯（即miRNA表達差異倍數最大）的靶基因，并通過DAVID生物信息學資源數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對其進行KEGG通路富集分析。

1.4.6 差異表達最明顯的miRNA對心肌HCM-a細胞增殖的影響 采用CCK-8法檢測差異表達最明顯miRNA對心肌HCM-a細胞的影響。該miRNA特異性干擾物（siRNA）、模擬物（mimics）和陰性對照物（NC）均由北京歐林格生物技術有限公司合成，轉染試劑為Lipo-fectamine 2000（美國Invitrigen公司）。取心肌HCM-a細胞（美國ATCC公司）適量，接種至6孔板中，待細胞融合至60%時進行轉染試驗。將細胞隨機分為空白組、NC組、siRNA組和mimics組，每組設置3個復孔。在轉染前，先將siRNA、mimics、NC和轉染試劑分別加至OPTIMEMⅠ無血清培養基（美國Gibco公司）100 μL中，室溫孵育5 min后，將含轉染試劑的培養基（100 μL）分別與含siRNA、mimics、NC的培養基（100 μL）混合（1∶1，V/V），使siRNA、mimics、NC終濃度均為1×10－7mol/L，即得相應轉染混合液。室溫孵育20 min后，將上述轉染混合液轉染至相應組別的心肌HCM-a細胞中，并加入含10%BSA的RPMI 1640培養基（即完全培養基，下同）1.8 mL（終體積為2 mL），空白組不作處理。轉染6 h后，更換新鮮的完全培養基，繼續轉染12 h，收集細胞，用胰蛋白酶（美國Solarbio公司）2 mL消化，隨后加入完全培養基配制單細胞懸液，取一部分以2×105個/孔接種于6孔板中，按“1.4.4”項下方法檢測mRNA的相對表達量，以評價轉染效果；取另一部分以5 000個/孔接種于至96孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養過夜，按照CCK-8試劑盒（日本DojinDo公司）說明書步驟處理48 h后，以SpectraMax M2型多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值（OD值越高，表示增殖能力越強）。上述試驗重復3次。

1.5 安全性評價

記錄兩組患者治療過程中不良反應的發生情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數或率表示，組間比較采用χ2檢驗或精確概率檢驗；計量資料以x±s表示，組間比較采用LSD-t或重復測定方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫落情況

A組有8例患者脫落，B組有6例患者脫落，脫落原因均為失聯，總體脫落率為7.69%。最終有168例患者完成本研究，其中A組80例、B組88例。

2.2 兩組患者血脂水平比較

治療前，兩組患者TC、LDL-C、HDL-C水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療后第60、90天，兩組患者的HDL-C水平均顯著增高，且B組顯著高于同時間點A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而治療前后兩組患者TC、LDL-C水平，治療后第30天HDL-C水平組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

表2 兩組患者治療前后血脂水平比較（x±s，mmol/L）Tab 2 Comparison of blood lipid levels between 2 groups before and after treatment（x±s，mmol/L）

2.3 兩組患者外周血EPCs陽性細胞數比較

治療后第30天，兩組患者外周血EPCs陽性細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療后第60天，B組患者外周血EPCs陽性細胞數顯著增多，且顯著多于同時間點A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而A組患者外周血EPCs陽性細胞數與治療后第30天比較，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 兩組患者外周血EPCs陽性細胞數比較（x±s，個）Tab 3 Comparison of the number of EPCs positive cells in peripheral blood between 2 groups（x±s，case）

2.4 EPC-MVs中差異表達的miRNA

與A組比較，B組患者EPC-MVs中表達差異超過1.5倍（兩組患者reads數的比值，包括增加和減小）的miRNA共有16個，其中包括7個上調表達miRNA（hsamiR-1228-5p、hsa-miR-126、hsa-miR-1275、hsa-miR-3176、hsa-miR-4521、hsa-miR-544b、hsa-miR-7974），9個下調表達 miRNA（hsa-let-7b-3p、hsa-miR-105-5p、hsamiR-122-5p、hsa-miR-200c-3p、hsa-miR-3180、hsa-miR-375、hsa-miR-494-5p、hsa-miR-7641、hsa-miR-7704），差異均有統計學意義（P＜0.05）。其中，差異表達最明顯的是hsa-miR-126，B組是A組的20.91倍，詳見表4（表中結果表示每個特異性芯片富集miRNA的reads數）。

由表4可見，差異表達排前5位的分別為hsa-miR-126（上調）、hsa-miR-1275（上調）、hsa-miR-7704（下調）、hsa-miR-105-5p（下調）、hsa-miR-3180（下調），其qRTPCR引物序列見表5，qRT-PCR擴增結果見表6。由表6可見，B組患者hsa-miR-126、hsa-miR-1275的相對表達量均顯著升高，hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相對表達量均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），與芯片檢測結果一致。

表4 兩組患者EPC-MVs中miRNAs表達譜的檢測結果（x±s）Tab 4 Results of expression profile of miRNAs in EPC-MVs in 2 groups（x±s）

表5 qRT-PCR引物序列Tab 5 qRT-PCR primer sequences

表6 兩組患者EPC-MVs中差異表達排前5位的miRNAs的相對表達量比較（x±s）Tab 6 Comparison of relative expression of top 5 differentially expressed miRNAs in EPC-MVs between 2 groups（x±s）

2.5 表達差異最明顯miRNA的靶基因預測及KEGG通路富集分析

由“2.4”項下結果可知，兩組患者hsa-miR-126表達差異最為明顯，其靶基因預測與KEGG通路富集分析結果顯示，hsa-miR-126的靶基因包括Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3、HIF-1、TGF-β等，參與調節的信號通路主要包括血管生成信號通路、慢性骨髓性白血病相關通路、腎上皮細胞癌相關通路、Wnt信號通路以及ErbB信號通路，詳見表7。

2.6 hsa-miR-126對心肌HCM-a細胞增殖的影響

利用hsa-miR-126的siRNA、mimics（引物序列見表8；其中，mimics為雙鏈結構，有上、下游兩個引物）分別轉染成人心肌HCM-a細胞。qRT-PCR結果顯示經轉染后，與空白組比較，siRNA組細胞miRNA的相對表達量顯著降低，mimics組細胞miRNA的相對表達量顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而NC組細胞miRNA的相對表達量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。CCK-8試驗結果顯示，與空白組比較，siRNA組細胞的OD值顯著降低，mimics組細胞的OD值顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而NC組細胞的OD值與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表9。

表7 hsa-miR-126靶基因及KEGG通路富集分析結果Tab 7 Analysis results of target gene and KEGG pathway enrichment of hsa-miR-126

表8 hsa-miR-126及其siRNA、mimics引物序列Tab 8 Primer sequences of hsa-miR-126 and its si-RNAand mimics

表9 hsa-miR-126的轉染及CCK-8試驗結果（x±s，n＝3）Tab 9 Results of hsa-miR-126 transfection and CCK-8 test（x±s，n＝3）

2.7 兩組患者治療前后不良反應發生情況

兩組患者主要的不良反應為腹瀉、惡心嘔吐、皮疹、血脂異常和轉氨酶輕度升高等。兩組患者各不良反應的發生率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表10。

表10 兩組患者不良反應發生率比較[例（%%）］Tab 10 Comparison of the incidence of ADR between 2 groups[case（%%）］

3 討論

冠心病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起的血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟疾病[10］。血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動環節，是其常見的病理基礎之一[11］。EPCs是血管內皮修復的主要執行者，在此修復過程中，其可分泌細胞因子，誘導新血管再生，加速血管內皮化，并保護心肌細胞免受損傷或恢復受損心肌細胞的活力[7，12］。EPCs是體現血管內皮功能狀態及健康程度的生物標志物，其數量的減少被認為與不良心血管事件、支架內新生內膜不良增生及血管內皮功能障礙等有關[7，13-14］。由此可見，探討急性STEMI患者PCI術后長期服用阿托伐他汀對體內EPCs的增殖及MVs分泌功能的影響是研究如何有效保護心肌細胞免受損傷的重要途徑之一[7］。

他汀類藥物是臨床常用藥物，可顯著降升高HDL-C水平，而后者是EPCs數量和功能的重要決定因素之一[3］。此外有研究指出，他汀類藥物可通過誘導EPCs的分化來促進動物缺血心肌細胞的恢復[15-16］。為此，本研究探討了不同劑量阿托伐他汀對STEMI患者血脂水平和ECPs數量的影響。結果顯示，在接受阿托伐他汀治療后第60、90天，兩組患者HDL-C水平均較治療前顯著升高，且B組顯著高于同時間點A組；治療后第60天，B組患者外周血EPCs陽性細胞數較同組治療后第30天顯著升高，且顯著多于同時間點A組。這提示不同劑量的阿托伐他汀均可明顯提高患者體內HDL-C水平，且大劑量阿托伐他汀可有助于提高患者外周血中EPCs的數量。但本研究并未發現阿托伐他汀對TC、LDL-C水平的影響，可能與本研究樣本量較小、研究時間較短等因素有關。

血漿miRNAs的穩定性、組織特異性以及其在疾病狀態下的差異表達使其有可能成為新的生物學標記物[17］。在心血管研究領域，越來越多的miRNAs被證實與急性心肌梗死的發生、發展有關[7，18］。同時有研究指出，MVs可抑制心肌細胞肥大和凋亡，并促進受損心肌細胞恢復；EPC-MVs可介導血管修復與再生、細胞內皮化等生物學調控過程，而hsa-miR可能參與了上述過程[4-6］。為此，本研究借助基因芯片技術對兩組患者miRNAs的表達情況進行了檢測和分析。芯片結果顯示，與A組比較，B組患者EPC-MVs中表達差異超過1.5倍的miRNA共有16個，包括7個上調、9個下調表達miRNA，其中表達差異前5位的分別為hsa-miR-126（上調）、hsa-miR-1275（上調）、hsa-miR-7704（下調）、hsa-miR-105-5p（下調）、hsa-miR-3180（下調）。qRT-PCR結果顯示，B組患者hsa-miR-126、hsa-miR-1275的相對表達量均顯著升高，hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相對表達量均顯著降低，與基因芯片檢測結果一致。

在這5個差異表達的miRNAs中，hsa-miR-126的表達差異最明顯（B組是A組的20.91倍）。hsa-miR-126是來源于內皮細胞的miRNA[19］。有研究指出，冠心病患者血漿hsa-miR-126的表達水平有所降低，且該表達水平與心力衰竭患者的年齡和紐約心臟病協會（NYHA）心功能分級呈負相關[18］，表明hsa-miR-126表達的下調可作為心血管疾病患者的獨立危險因素[20］。本研究對hsamiR-126的靶基因及KEGG富集通路進行了預測和分析，并借助CCK-8試驗評價了其對心肌HCM-a細胞增殖的影響。預測結果顯示，hsa-miR-126參與調節的信號通路主要包括血管生成信號通路、慢性骨髓性白血病相關通路、腎上皮細胞癌相關通路、Wnt信號通路以及ErbB信號通路等，靶基因涉及Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3等。qRT-PCR結果顯示，經轉染后，siRNA組細胞miRNA的相對表達量較空白組顯著降低，mimics組細胞miRNA的相對表達量較空白組顯著升高，提示轉染改變了hsa-miR-126的表達。CCK-8試驗結果顯示，siRNA組細胞的OD值顯著降低，mimics組細胞的OD值顯著升高，提示hsa-miR-126對心肌HCM-a細胞的增殖具有一定的促進作用。

安全性評價結果顯示，在治療過程中，兩組患者腹瀉、惡心嘔吐、皮疹、血脂異常和轉氨酶輕度升高的發生率比較，差異均無統計學意義。這提示增加阿托伐他汀的劑量并不會對其安全性造成影響。

綜上所述，不同劑量的阿托伐他汀均可調節患者體內HDL-C水平，大劑量阿托伐他汀可顯著提高EPCs的數量，且不會影響用藥的安全性。兩組患者EPC-MVs中的差異表達miRNA共有16個，其中7個上調、9個下調，表達差異最明顯的為hsa-miR-126（上調）。hsa-miR-126可通過Ang-1、PDGF、p38MAPK、Smad2/3等靶基因來調控血管生成信號通路、慢性骨髓性白血病相關通路等信號通路，從而發揮對心肌細胞增殖的促進作用。但本研究尚未進一步確證hsa-miR-126參與調控的靶基因和信號通路，也并未考觀察患者的長期療效和復發情況，加之樣本量和研究時間有限，故上述結論尚有待大樣本、多中心臨床研究予以證實。