檸檬酸對高脂血癥小鼠胰島素敏感性的影響

王妙穎，阿依姑麗g艾合麥提*，曹夢麗，艾力牙爾g吾不力

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

高脂血癥表現為體內血漿一種或數種脂質成分的含量超過正常最高限值的狀態，在營養代謝性疾病中占有重要的地位，是導致動脈粥樣硬化的主要因素之一[1]，與高血壓、心腦血管病[2-3]和腎臟病的發生關系密切[4]。在我國，此癥并不罕見，根據中國居民營養與健康狀況報告的調查結果[5]，我國成人高脂血癥的患病率為20%，血脂異常者約有1.6億，近年來其患病率及死亡率還有逐年增高的趨勢，尤其多見于中、老年人。研究表明，高脂血癥與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）有著密切的關系[6-7]，IR是指血液中胰島素的生物效應降低，即機體對胰島素生物調節作用的反應性降低的一種狀態，具體表現為機體對胰島素的敏感性下降以及對葡萄糖的利用產生障礙[8]。胰島素抵抗不僅是一種代謝疾病，而且是高血脂、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等代謝疾病之間的紐帶[9]，更是II型糖尿病的發病基礎和伴隨性狀[10]。近幾年，胰島素抵抗患者人數呈指數增加，因此防治胰島素抵抗顯得尤為重要。

檸檬酸（citricacid，CA）又名枸櫞酸，在自然界中分布廣泛，存在于植物的果實和動物的骨骼、肌肉、血液中，無色或白色晶體、無臭、味酸，易溶于水和乙醇，其應用非常廣泛，在食品、飼料、日化、化工制藥和紡織業等領域有著重要的應用[11]，如作為酸性調味劑[12]、抗氧化劑[13]、化學分析用試劑，實驗試劑、色譜分析試劑及生化試劑、絡合劑、掩蔽劑，還可用以配制緩沖溶液。檸檬酸是三羧酸循環的重要中間產物，三羧酸循環又是三大營養素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，也是糖類、脂類、氨基酸代謝聯系的樞紐。本項目組對新疆野山杏果肉總有機酸成分的研究結果顯示，檸檬酸占野山杏果肉總有機酸含量的70%以上，是野山杏果肉總有機酸成分中的主酸[14]。針對野山杏果肉的總有機酸，本項目組前期已進行了分離純化[15]、體外抗脂質過氧化活性[16]、對高脂血癥大鼠血脂及抗氧化指標的影響[17]以及對高脂血癥小鼠血脂和肝臟的影響[18]等方面的研究，但對于野山杏果肉總有機酸成分中的檸檬酸相關研究卻很少。本實驗通過建立高脂血癥實驗小鼠模型，考察檸檬酸調節血脂的作用和對高脂血癥小鼠胰島素敏感性的改善作用，以期為后續野山杏果肉總有機酸成分的研究提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

KM小鼠，60 只，雌雄各半，體質量（20f2）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（新）2016-0003。

檸檬酸（質量分數≥99.5%） 天津市致遠化學試劑有限公司；血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司；小鼠胰島素酶聯免疫吸附檢測試劑盒 伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）寶生物工程（大連）有限公司；總RNA提取試劑TRIzol、AL2000 DNA Marker（100、250、500、750、1 000、2 000 bp） 南京鐘鼎生物技術有限公司；凝膠染色試劑 北京全式金生物技術有限公司；DEPC美國Sigma公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TG）測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、丙基硫氧嘧啶、1,2-丙二醇、膽固醇、膽酸鈉、吐溫-80均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

血糖儀 德國羅氏診斷有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 瑞士Roche公司；臺式高速冷凍離心機美國Beckman公司；電子天平 美國Ahoms公司；恒溫水浴鍋、紫外透射儀 美國Amersham Pharmacia公司；雪花狀制冰機 日本Sanyo公司；移液器 德國Eppendorf公司；xMark-10593酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

實驗前將檸檬酸和血脂康用質量分數0.5% CMC-Na配成實驗所需質量濃度。

高脂乳劑的配制[19]：將1 g丙硫氧嘧啶于研缽中研細，存放備用。取20 g豬油于60 ℃水浴中加熱融化，置于研缽中，加入10 g膽固醇、1 g丙硫氧嘧啶，充分攪拌，溶解。再分別加入20 mL吐溫-80、丙二醇，研磨混勻，然后緩慢加入20 mL體積分數10%膽酸鈉水溶液，研磨乳化，加蒸餾水至100 mL，裝入密閉容器中，冷藏，使用時先于37 ℃水浴中融化。

1.3.2 動物分組及給藥

KM小鼠適應性飼養1 周后，隨機分為6 組，每組10 只，即空白對照組、高脂模型組（hyperlipidemia model，HM）、陽性對照組、高劑量檸檬酸組（CA＋HM（H））、中劑量檸檬酸組（CA＋HM（M））及低劑量檸檬酸組（CA＋HM（L））。

空白對照組每天灌胃生理鹽水，其余5 組均于每天上午灌胃高脂乳劑，每天下午陽性對照組灌胃0.2 g/kg的血脂康，CA＋HM（H）、CA＋HM（M）、CA＋HM（L）組分別灌胃0.4、0.2、0.1 g/kg的檸檬酸（灌胃量按10 mL/kg mb計算）。

1.3.3 口服糖耐量測定

于實驗第30天，小鼠禁食12 h，尾部采血測血糖值，空白對照組灌胃生理鹽水、HM組灌胃高脂乳劑、陽性對照組灌胃血脂康及CA＋HM組灌胃不同劑量的CA，20 min后給予各組小鼠灌胃2.0 g/kg葡萄糖（灌胃量按10 mL/kg mb計算），測定0、15、30、60、120 min的血糖濃度，并按照公式（1）計算各組在0～120 min內的血糖曲線下面積（area under the curve of blood glucose，GAUC）[20]。

1.3.4 動物的處理和生化指標的測定

于實驗第30天，禁食12 h，尾部采血測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）濃度，眼眶采血，制備血清，脫臼處死小鼠，解剖，快速摘取肝臟和四肢骨骼肌，并放入液氮中，用于測定肝臟6-磷酸葡萄糖酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）mRNA和四肢骨骼肌葡萄糖轉運體4（glucose transporter-4，GLUT-4）mRNA表達量；按照試劑盒說明分別測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度和胰島素水平，并分別按式（2）、（3）計算胰島素敏感指數（insulin sensitive index，ISI）及胰島素抵抗指數（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）[21]。

式中：FIN為空腹胰島素（fasting insulin）。

1.3.5 肝臟G-6-Pase mRNA和四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA的提取及測定

取出上述放入液氮中的肝臟和四肢骨骼肌，用TRIzol分別提取肝臟和四肢骨骼肌的總RNA；采用反轉錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）法，通過Oligo（dT）Primer或dNTP Mixture將RNA反轉錄成cDNA，根據基因序列設計特異性引物，運用qPCR，采用SYBR Green染料法，以β-actin為內參基因，做相對定量檢測，并用2－△△Ct法對數據進行相對定量分析，引物的設計見表1。

表1 PCR擴增基因引物序列Table1 Primer sequences used for PCR amplif i cation of genes

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，實驗結果以fs表示，組間差異的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，并利用GraphPad作圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠空腹血清血脂水平的變化

表2 小鼠血清血脂水平（n＝10）Table2 Serum lipid levels in mice (n= 10)mmol/L

由表2可見，與空白對照組相比，HM組血清的TG和TC濃度極顯著升高（P＜0.01），HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），LDL-C濃度顯著升高（P＜0.05），說明高脂血癥模型造模成功；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的濃度有不同程度的升高或降低，其中TG、TC和LDL-C濃度顯著降低（P＜0.05），HDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），但與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；與陽性對照組相比，CA＋HM（M）組血清TC的濃度有顯著差異（P＜0.05），CA＋HM（H）組血清HDL-C和LDL-C的濃度有顯著差異（P＜0.05），CA＋HM（L）組血清HDL-C的濃度有顯著差異（P＜0.05），CA＋HM組血清TG的濃度雖比陽性對照組高，但無顯著差異（P＞0.05）；不同劑量的CA＋HM組之間均無顯著差異（P＞0.05），且無劑量依賴性。說明檸檬酸能夠調節高脂血癥小鼠的血清血脂水平。

2.2 檸檬酸對高脂血癥小鼠糖耐量的影響

表3 檸檬酸對小鼠糖耐量的影響（n＝10）Table3 Effect of citric acid on oral glucose tolerance (n= 10)

由表3可見，與空白對照組相比，HM組空腹及灌糖2 h后的血糖濃度極顯著升高（P＜0.01）；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組的血糖濃度有不同程度降低，其中0、60 min和120 min的CA＋HM組和陽性對照組血糖濃度極顯著降低（P＜0.01），與空白對照組相比，血糖濃度雖有所下降但無顯著差異（P＞0.05）；與陽性對照組相比，0、15 min和60 min的CA＋HM（M）組血糖濃度有顯著差異（P＜0.05），30 min和120 min的CA＋HM（H）組血糖濃度有顯著差異（P＜0.05）；30 min的CA＋HM（L）組血糖濃度有顯著差異（P＜0.05）；不同劑量的CA＋HM組之間均無顯著差異（P＞0.05）且無劑量依賴性。說明高脂血癥小鼠機體對糖的利用率降低，糖代謝存在異常，檸檬酸能夠干預高脂血癥小鼠的糖代謝過程，并能夠調節使之趨于正常。

2.3 小鼠血糖曲線下面積的變化

表4 各組小鼠血糖曲線下面積（n＝10）Table4 Comparison of area under the curve of blood glucose in six groups (n= 10)

由表4可見，與空白對照組相比，HM組的血糖曲線下面積差異極顯著（P＜0.01）；與HM組相比，CA＋HM各劑量組和陽性對照組的血糖曲線下面積差異顯著（P＜0.05）；與空白對照組相比，CA＋HM組和陽性對照組血糖曲線下面積均無顯著差異（P＞0.05）；與陽性對照組相比，CA＋HM組的血糖曲線下面積均無顯著差異（P＞0.05）；不同劑量的CA＋HM組之間也均無顯著差異（P＞0.05）且無劑量依賴性。進一步說明HM組的糖代謝存在異常，檸檬酸能夠干預高脂血癥小鼠的糖代謝過程，提高高脂血癥小鼠機體對糖的利用率，并調節糖代謝。

2.4 檸檬酸對高脂血癥小鼠胰島素敏感性的影響

表5 檸檬酸對高脂血癥小鼠胰島素敏感性的影響（n＝10）Table5 Effect of citric acid on insulin sensitivity in hyperlipidemic mice (n= 10)

由表5可見，與空白對照組相比，HM組的FIN含量和HOMA-IR極顯著升高（P＜0.01），ISI極顯著降低（P＜0.01），說明高脂血癥小鼠機體產生了胰島素抵抗，對胰島素的敏感性降低；與HM組相比，CA＋HM各劑量組和陽性對照組的FIN含量、ISI和HOMA-IR有不同程度的升高或降低，其中CA＋HM（H）組ISI極顯著升高（P＜0.01），FIN含量極顯著降低（P＜0.01），HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），CA＋HM（M）組ISI顯著升高（P＜0.05），FIN含量和HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），CA＋HM（L）組ISI顯著升高（P＜0.05），FIN含量極顯著降低（P＜0.01），HOMA-IR顯著降低（P＜0.05），但與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），陽性對照組ISI極顯著升高（P＜0.01），FIN含量顯著降低（P＜0.05），HOMA-IR極顯著降低（P＜0.01）；與陽性對照組相比，CA＋HM（L）組HOMA-IR有顯著差異（P＜0.05）；不同劑量的CA＋HM組之間均無顯著差異（P＞0.05）且無劑量依賴性。說明高脂血癥小鼠經檸檬酸干預后，提高了機體對胰島素的敏感性，并減弱了高脂血癥小鼠的胰島素抵抗。

2.5 肝臟和四肢骨骼肌的RNA檢測結果

圖1 肝臟及四肢骨骼肌總RNA的RT-PCR結果Fig.1 Electrophoretic detection of RT-PCR-amplif i ed total RNA from liver and skeletal muscle

由圖1A可知，與空白對照組相比，HM組肝臟總RNA條帶亮度明顯升高；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組的肝臟總RNA條帶亮度明顯降低，但與空白對照組相比無明顯差異；與陽性對照組相比，CA＋HM（H）組肝臟總RNA條帶亮度升高；不同劑量的CA＋HM組之間無明顯差異。由圖1B可知，與空白對照組相比，HM組四肢骨骼肌總RNA條帶亮度明顯降低；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組四肢骨骼肌總RNA條帶亮度升高；與陽性對照組相比，CA＋HM（H）組四肢骨骼肌總RNA條帶亮度升高；CA＋HM（H）組四肢骨骼肌總RNA條帶亮度高于CA＋HM（M）和CA＋HM（L）組。

2.6 肝臟G-6-Pase mRNA表達量的改變

圖2 肝臟G-6-Pase mRNA表達量的改變Fig.2 Comparison of G-6-Pase mRNA expressions in liver in six groups

由圖2可見，與空白對照組相比，HM組肝臟G-6-Pase mRNA的表達量極顯著升高（P＜0.01），說明高脂血癥小鼠對糖的利用率降低；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組肝臟G-6-Pase mRNA的表達量顯著下調（P＜0.05），但與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；與陽性對照組相比，CA＋HM（H）組G-6-Pase mRNA的表達量有顯著差異（P＜0.05）；不同劑量的CA＋HM組之間均無顯著差異（P＞0.05）且無劑量依賴性。說明檸檬酸增加了高脂血癥小鼠機體對肝糖的利用率，同時有效地抑制了肝臟G-6-Pase mRNA的表達。

2.7 四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA表達量的改變

圖 3 四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA表達量的變化Fig.3 Comparison of GLUT-4 mRNA expressions in skeletal muscle in six groups

由圖3可見，與空白對照組相比，HM組四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達量極顯著降低（P＜0.01），再次說明高脂血癥小鼠機體對糖的利用率降低；與HM組相比，CA＋HM組和陽性對照組四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達量顯著上調（P＜0.05），但與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；與陽性對照組相比，CA＋HM組四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達量無顯著差異（P＞0.05），即經檸檬酸干預后效果與血脂康持平；不同劑量的CA＋HM組之間均無顯著差異（P＞0.05）且無劑量依賴性。說明檸檬酸增加了高脂血癥小鼠機體對糖的利用率，同時有效地提高了骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達。

3 討 論

本實驗中，與正常對照組相比，高脂模型組的小鼠血清TC、TG和LDL-C濃度升高，HDL-C濃度降低，血糖濃度升高，降糖能力減弱，FIN含量和HOMA-IR明顯升高，ISI明顯降低，說明高脂血癥小鼠已經出現了胰島素抵抗的基本性狀，且對胰島素的敏感性下降；與高脂模型組相比，檸檬酸干預組小鼠的血清血脂水平和胰島素水平各項指標差異顯著，說明即使灌胃了高脂乳劑，但在檸檬酸的干預下，高脂血癥小鼠血清中的TC、TG和LDL-C濃度降低，HDL-C濃度升高，血糖濃度降低，降糖能力提高，FIN含量和HOMA-IR明顯下調，ISI明顯上調，肝臟G-6-Pase mRNA表達量下調，骨骼肌GLUT-4 mRNA表達量上調。實驗結果表明，檸檬酸可以調節高脂血癥小鼠的血清血脂水平，并能夠有效調節糖代謝過程，提高機體對胰島素的敏感性，減弱高脂血癥小鼠的胰島素抵抗，增加葡萄糖在機體中的利用率。本實驗中3 個不同劑量的檸檬酸組之間無劑量依賴性，為后續野山杏果肉總有機酸成分中檸檬酸的研究提供了實驗依據。

目前的研究表明，脂代謝紊亂是誘發高脂血癥的關鍵原因，血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的濃度可在一定程度反映機體脂代謝狀況，是監測血脂變化的重要指標[22]，本實驗選擇測定血清TG、TC、HDL-C和LDL-C濃度4 個指標，以反映模型組小鼠血脂的異常情況。高血脂在大多數情況下可誘發胰島素抵抗[23]，降低機體對胰島素的敏感性，本實驗中檸檬酸調節了高脂血癥小鼠的血脂水平，改善了胰島素的敏感性，但檸檬酸通過調節血脂水平從而改善胰島素的敏感性，還是調節血脂水平的同時改善胰島素的敏感性，尚待進一步的研究。發生胰島素抵抗的主要部位是依賴胰島素的葡萄糖利用器官，如骨骼肌、肝臟、脂肪組織等[24]，肝臟G-6-Pase mRNA表達量的異常升高和四肢骨骼肌GLUT-4 mRNA表達量的降低是胰島素抵抗的重要標志[25-26]，胰島素抵抗的發生機制與胰島素受體有關，在胰島素作用的受體前水平、受體水平及受體后水平的任何一個階段都可導致胰島素抵抗[27-28]，胰島素受體對葡萄糖在體內的轉運代謝是由胰島素受體依賴性葡萄糖運載體及許多關鍵酶活化的結果[29]。本實驗中，檸檬酸提高機體對胰島素的敏感性，減弱高脂血癥小鼠胰島素抵抗，增加葡萄糖在機體中的利用率，可能的機制是：檸檬酸抑制了受體后水平的胰島素抵抗，具體機制還需進行細胞水平的研究。檸檬酸在三羧酸循環中扮演著非常重要的角色，連接著三大物質代謝的基礎（糖、脂類、氨基酸），更直接關系著機體的健康。檸檬酸在體內的代謝過程為：檸檬酸→異檸檬酸→α-酮戊二酸→琥珀酰輔酶A→琥珀酸→延胡索酸→L-蘋果酸→草酰乙酸＋乙酰輔酶A→檸檬酸循環[30]。本實驗中，外源性補充的檸檬酸進入機體后參與了三羧酸循環，調節了高脂血癥小鼠的血脂水平，改善了胰島素的敏感性，但發揮功效的成分主要是檸檬酸，還是以其代謝產物發揮的作用，還需進一步的研究。