特殊富含AT序列結(jié)合蛋白1在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞增殖的影響①

張麗娜 許昕瑜 郭松佳 任云青

(山西醫(yī)科大學汾陽學院，汾陽032200)

根據(jù)GLOBOCAN的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2018年全球胃癌新發(fā)病例約103.3萬例(1/18)，死亡病例約78.3萬例(1/12)，分別位于惡性腫瘤發(fā)病率第5位、死亡率第2位[1]。由于該腫瘤侵襲力強、生長迅速且易早期轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，盡管該腫瘤細胞對放化療敏感，但治愈率較低，多數(shù)患者治療后仍會復發(fā)或轉(zhuǎn)移，預后較差[2]。因此，研究胃癌細胞的發(fā)生發(fā)展機制對指導胃癌的治療具有重要意義。

特殊富含AT序列結(jié)合蛋白1(Special AT rich sequence binding protein 1，SATB1)是一種核基質(zhì)結(jié)合蛋白[3-5],最先是由Han等[6]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，SATB1過表達可促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。近年研究發(fā)現(xiàn)，SATB1在肺癌、結(jié)直腸癌和肝癌等多種惡性腫瘤中過表達，并能夠調(diào)節(jié)多個腫瘤相關(guān)基因如MMP2、MMP9、c-myc、Bcl-2、β-catenin 等基因的轉(zhuǎn)錄[7]。目前，有學者證實SATB1在胃癌細胞SGC-7901中高表達[8]，胃癌組織中SATB1的高表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且與患者預后不良有密切關(guān)系[9]。那么，SATB1在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著怎樣作用，其對胃癌細胞增殖產(chǎn)生何種影響，又是通過何種途徑影響增殖尚待進一步研究。因此，本實驗試圖通過研究SATB1對胃癌細胞增殖的影響，初步探討SATB1在胃癌發(fā)生中的機制，為胃癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 收集2015年1月～2018年5月在山西省汾陽醫(yī)院手術(shù)治療的經(jīng)病理確診為胃癌的腫瘤組織、淋巴結(jié)組織(含轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織)、癌旁組織標本30例。術(shù)前均未接受放化療、分子靶向及免疫治療。

1.1.2主要試劑和儀器 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-His-SATB1、沉默質(zhì)粒pPLK+Puro-SATB1 shRNA、載體質(zhì)粒pcDNA3.1、pPLK+Puro購于南京PPL公司；免疫組化試劑盒、細胞培養(yǎng)基、WB試劑、BCA試劑盒、CCK8試劑盒、雙抗購于博士德；AKT、p-AKT抗體、二抗均購于北京索萊寶公司；兔抗人SATB1多克隆抗體購自Bioss公司；胎牛血清購自四季青公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量RT-PCR酶均購自天根生化科技有限公司；細胞株由山西醫(yī)科大學汾陽學院張笑添老師惠贈。酶標儀購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化技術(shù) 標本石蠟塊切片，75℃恒溫箱中放置6 h，自然冷卻。切片脫蠟、水合，3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉緩沖液行熱修復，山羊血清封閉，靜置20 min，滴加SATB1抗體(1∶400)。陰性對照滴加PBS緩沖液代替一抗，切片在4℃下過夜。復溫、洗片后滴加二抗、顯色液，沖洗、蘇木素復染、脫水，最后用中性樹膠蓋片。結(jié)果采用半定量積分法判定[10]。

1.2.2熒光定量RT-PCR 參照RNA提取試劑盒操作說明提取MGC-803及GES-1的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增。引物序列如下：GAPDH正向：5′-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3′，GAPDH反向：5′-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3′;SATB1正向：5′-AGCCCAGCAGTCCTTAAACC-3′，SATB1反向：5′-CAGTTCATCGCGTACCCACT-3′。GAPDH作為內(nèi)參。PCR擴增條件：95℃、1 min預變性；94℃、30 s，58℃、30 s，74℃、30 s，共38個循環(huán);74℃延伸15 min，4℃保存。實驗數(shù)據(jù)(Ct值)采用 2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計。實驗重復3次。

1.2.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MGC-803和GES-1分別在含有10%胎牛血清、10 U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640、DMEM中培養(yǎng)，細胞置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細胞分為5組：① 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-His-SATB1組(簡稱His-SATB1)；② 載體質(zhì)粒pcDNA3.1組(簡稱His-N)；③ 沉默質(zhì)粒pPLK+Puro-SATB1 shRNA組(簡稱sh-SATB1)；④ 沉默載體質(zhì)粒pPLK+Puro組(簡稱sh-N)；⑤ 空白對照組(MGC-803細胞，簡稱803)。細胞生長密度達80%～90%時，在電擊轉(zhuǎn)染參數(shù)160 V、15 ms的條件下將His-SATB1、His-N、sh-SATB1、sh-N四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MGC-803細胞。

1.2.4Western blot 提取細胞總蛋白，BCA 試劑盒對蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量行10% SDS-PAGE，蛋白分離后轉(zhuǎn)至NC 膜，室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，其中目的蛋白抗體和內(nèi)參β-actin抗體分別按照1∶300和1∶7 000稀釋。洗膜，室溫孵育二抗(1∶10 000 稀釋的HRP標記的羊抗兔 IgG) 1 h，洗膜，顯色。

1.2.5CCK8檢測細胞增殖 取上述轉(zhuǎn)染24 h的細胞，每孔加入10 μl CCK8試劑，培養(yǎng)2 h后，酶標儀測定490 nm波長處吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1SATB1在胃癌組織中的表達 結(jié)果如圖1所示，SATB1主要定位于細胞核內(nèi)，細胞漿中有少量表達。SATB1在胃癌組織和癌旁組織中的表達率分別為60%(18/30)和16.7%(5/30)，在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織及未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達率分別為71%(10/14)和6.2%(1/16)；胃癌組織中的SATB1陽性率比癌旁組織的陽性表達率高(χ2= 11.91，P=0.001)，在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達水平較未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的表達水平高(χ2=13.66，P=0.000)。

2.2SATB1在MGC-803和GES-1細胞中的表達 如圖2所示，MGC-803、GES-1中SATB1 mRNA相對表達水平分別為20.42±0.30、1，SATB1 mRNA在MGC-803細胞中表達水平顯著高于GES-1細胞(t=64.43，P<0.000 1)。SATB1蛋白在MGC-803及GES-1細胞中的相對表達水平分別為2.04±0.17、0.66±0.06，MGC-803細胞中SATB1蛋白的表達水平顯著升高(t=7.66，P<0.01)。蛋白與基因表達差異相一致。

2.3SATB1在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的MGC-803細胞中的表達 將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒以及基因沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到MGC-803細胞中，轉(zhuǎn)染24 h后， Western blot檢測SATB1蛋白表達。sh-SATB1組、sh-N組、His-SATB1組及His-N組MGC-803細胞中SATB1蛋白相對表達量分別是2.17±0.11、4.64±0.29、12.64±0.57、5.33±0.17(圖3)，差異有統(tǒng)計學意義(F=155，P<0.000 1)。sh-SATB1組MGC-803細胞SATB1蛋白表達水平顯著低于sh-N組(P<0.001)，His-SATB1組MGC-803細胞SATB1蛋白表達水平顯著高于His-N組(P<0.000 1)，sh-N組和His-N組SATB1蛋白表達水平與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4SATB1對MGC-803細胞增殖的影響 采用CCK8方法，分別檢測MGC-803細胞轉(zhuǎn)染后24、48和72 h的增殖情況，發(fā)現(xiàn)與sh-N組比較，sh-SATB1組細胞增殖能力顯著降低(t24=10.85，P24=0.000；t48=5.62，P48=0.004；t72=10.75，P72=0.000)；與His-N組細胞比較，His-SATB1組細胞增殖能力顯著升高(t24=3.91，P24=0.017；t48=2.84，P48=0.047；t72=2.87，P72=0.045)。見圖4。

圖2 SATB1在MGC-803及GES-1細胞中的表達Fig.2 Expression of SATB1 in gastric cancer cell lines and gastric mucosal epithelial cellsNote: A.Real-time quantitative PCR to detect the mRNA expression of SATB1;B.Western blot to detect the protein expression of SATB1;C.Grayscale scanning results of immunoblot.MGC-803 vs GES-1.****.P<0.000 1;**.P<0.01.

圖3 SATB1在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MGC-803細胞中的表達Fig.3 Expression of SATB1 in MGC-803 cell transfected with different plasmidsNote: A.Western blot to detect the expression of SATB1;B.SATB1/β-actin intensity band ratio.sh-SATB1 vs sh-N,***.P<0.001;His-SATB1 vs His-N,****.P<0.000 1.

圖4 SATB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對MGC-803細胞增殖的影響Fig.4 Effect of SATB1 plasmid transfection on prolifera-tion of MGC-803 cellsNote: sh-SATB1 vs sh-N group,*.P<0.05;His-SATB1 vs His-N group,*.P<0.05.

圖5 SATB1對MGC-803細胞 AKT和p-AKT蛋白表達的影響Fig.5 Effect of SATB1 on protein expression of AKT and p-AKT in MGC-803 cellNote: A.Western blot to detect the expression of AKT and p-AKT;B.The relative expression of protein;C.p-AKT/AKT intensity band ratio.*.P<0.05,**.P<0.01,sh-SATB1 vs sh-N,His-SATB1 vs His-N.

2.5SATB1對MGC-803細胞中AKT和p-AKT蛋白表達的影響 結(jié)果如圖5所示，sh-SATB1組MGC-803細胞中AKT、p-AKT的表達水平顯著降低(P<0.05)，His-SATB1組MGC-803細胞中AKT、p-AKT的表達水平顯著升高(P<0.05)。并且，sh-SATB1組p-AKT/AKT比值(0.71±0.04)較 sh-N組(0.96±0.07)降低，His-SATB1組p-AKT/AKT的比值(0.97±0.01)較His-N組(0.88±0.01)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

SATB1 是一種特殊富含AT序列的核基質(zhì)結(jié)合蛋白。1992年，Dickinson等[5]利用免疫球蛋白重鏈基因增強子3′端的MAR序列作為探針，從人類cDNA文庫中篩選得到SATB1基因，并證實SATB1基因位于3號染色體3p23區(qū)，編碼全長為 763 個氨基酸的蛋白質(zhì)。SATB1蛋白有5個重要的功能結(jié)構(gòu)域，即核定位信號(Nuclear localization signal，NLS)、PDZ結(jié)構(gòu)域(PSD-95，Disc-large，ZO-1)、核基質(zhì)靶向序列(Nuclear matrix targeting sequences，NMTS)、MARs結(jié)合區(qū)域(MARs binding domain，MD)和同源結(jié)構(gòu)域(Homeo-domain，HD)，通過這些結(jié)構(gòu)域SATB1促進基因重組和染色質(zhì)重建，并通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；图谆絹碚{(diào)控基因的表達[11]。

有研究發(fā)現(xiàn)SATB1在胃癌細胞中高表達，并與患者的不良預后相關(guān)[8,9]。但這些研究并未闡明SATB1在胃癌發(fā)生中的作用機制。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測30例胃癌組織、淋巴結(jié)組織及癌旁組織中SATB1的表達，結(jié)果表明胃癌組織中SATB1 陽性表達率顯著高于癌旁組織，體外實驗證實SATB1在MGC-803細胞株中高表達，這與Song等[8]的研究結(jié)果一致。表明SATB1的表達水平與胃癌的發(fā)生有關(guān)。本實驗將pPLK+Puro-SATB1 shRNA質(zhì)粒及pcDNA3.1-His-SATB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于MGC-803細胞中，結(jié)果顯示，當SATB1基因沉默后，MGC-803細胞的增殖能力也隨之降低，而當過表達SATB1后，MGC-803細胞的增殖能力明顯增強。由此可見，SATB1與胃癌細胞的增殖直接相關(guān)。

為了探究SATB1促進細胞增殖的機制，本研究檢測了增殖相關(guān)蛋白分子AKT的表達。AKT是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(即PI3K/AKT)信號轉(zhuǎn)導通路中的重要信號分子，是許多生長因子、細胞因子的下游調(diào)控分子，可促進細胞增殖、侵襲，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-15]。有研究顯示，在肝癌中，SATB1可通過調(diào)控AKT的表達來促進肝癌細胞的增殖[16]。那么在胃癌中，SATB1是否可調(diào)控AKT的表達，本實驗通過沉默或過表達SATB1來觀察AKT表達情況，結(jié)果顯示AKT表達會隨之降低或升高，推測SATB1可調(diào)控AKT的表達。另一方面，本研究中沉默或過表達SATB1后，p-AKT、p-AKT/AKT的表達隨之降低或升高，提示SATB1還可激活PI3K/AKT信號通路，活化的AKT再進一步激活其下游因子，如 Bcl-2 家族(抗凋亡蛋白家族)、糖原合成酶激酶 3和S6蛋白激酶等，對細胞增殖進行調(diào)節(jié)[17-19]，從而影響胃癌細胞的增殖。

綜上所述，SATB1在胃癌組織及胃癌細胞中高表達，抑制SATB1的表達可降低胃癌細胞的增殖能力，過表達SATB1可促進胃癌細胞的增殖能力，該現(xiàn)象的發(fā)生可能是通過調(diào)控AKT的表達和激活PI3K/AKT通路實現(xiàn)的，關(guān)于SATB1如何調(diào)控AKT并激活PI3K/AKT通路，還需要進一步深入研究。