HIF-1α對大鼠創(chuàng)傷后認知功能障礙的影響研究

張啟財，張 賽，孫中磊

研究表明顱腦創(chuàng)傷(Traumatic Brain Injury，TBI)可增加認知功能障礙發(fā)生的風險[1，2]。認知功能障礙的主要表現(xiàn)為Aβ升高，尤其是Aβ的寡聚形式在神經(jīng)元中的毒性作用，最終導致神經(jīng)突觸傳遞失敗[3，4]。神經(jīng)細胞生理需要持續(xù)供應氧和葡萄糖，TBI后的大腦組織中發(fā)現(xiàn)有氧糖酵解減少，導致細胞存活機制喪失，這與其他潛在的致病過程結合，最終導致神經(jīng)變性增加認知功能障礙的風險[5]。代謝減退可能改變淀粉樣蛋白β前體蛋白(amyloid β precursor protein，APP)的表達和轉換，最終導致Aβ的產生和清除失衡[6，7]。APP的過度表達、Aβ的產生和清除的不平衡可能是由于認知功能障礙患者的額葉、頂葉、枕葉皮質和紋狀體的葡萄糖代謝缺乏所致，認知功能障礙患者大腦皮質存在氧化能代謝缺陷[8]。這種與能量相關的代謝應激導致APP代謝改變并導致認知功能障礙中的淀粉樣變性[9]。

脯氨酸羥化酶(Prolyl Hydroxylase，PHD)可以識別低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)odd區(qū)脯氨酸殘基Pro402和N-TAD區(qū)的Pro564，使之發(fā)生羥基化，進而經(jīng)過希佩爾林道蛋白介導而進行泛素化降解。在缺氧條件或PHD抑制劑存在時，PHD羥基化活性下降，阻礙了HIF-1α的降解，使HIF-1α穩(wěn)定表達并積累，從而激活下游靶基因[10]。因此，PHD抑制劑被本研究采用作為提高HIF-1α水平的藥物。

缺氧誘導因子(HIF)是以適應缺氧改善葡萄糖代謝的細胞轉錄因子。在其他幾種疾病中發(fā)生作用，包括癌癥炎癥反應、抗細胞凋亡、血管生成和惡性細胞增殖[11，12]。雖然最近的實驗研究證明其穩(wěn)定表達在大腦中具有神經(jīng)保護作用，但它在認知功能障礙中的確切作用很少[13]。因此，關于HIF在認知功能障礙中作為神經(jīng)保護劑的可能對醫(yī)學研究具有重要意義。本研究探討了HIF在認知功能障礙中的作用及其未來前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體重200～300 g，由人民解放軍軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供，SCXK-(軍)2012-0004，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級動物室(SPF級)。

1.1.2 主要實驗器材與材料 電子腦皮質撞擊儀(eCCI，Custom&Design)，石蠟切片機(Leica)，熒光顯微鏡(OLYMPUS)，低溫離心機(深圳柯俊公司粉碎儀，Morris水迷宮(上海欣軟科技有限公司)，PHD抑制劑(MK-8617，MedchemExpress)，Anti-Rabbit Aβ1-42(Abcam)，Anti-Rabbit tau(Abcam)，Anti-Rabbit β-Tubulin(Abcam)，Anti-Rabbit HIF-1α(Abcam)，Anti-Rabbit - VEGF(Abcam)，Anti-Rabbit- EPO(Abcam)，TUNEL熒光試劑盒(Roche)。

1.2 方法

1.2.1 建立TBI大鼠模型 將大鼠隨機分為sham組(20只)、TBI組(20只)、PDH抑制劑組(10只)。采用皮質撞擊致傷法建立大鼠TBI模型[8]，術前6h禁食水。實驗組大鼠經(jīng)4%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉后，頭部剃毛，取俯臥固定于立體定向儀上，常規(guī)消毒鋪巾。沿矢狀切開頭皮，剝離骨膜，以囟點為原點(AP：-2.5 mm L：2.5 mm)(AP：-2.5 mm R：2.5 mm)分別行顱鉆鉆孔(直徑約4.0 mm)，顯露硬腦膜，并保持其完整無損。將eCCI打擊壁調整至與垂直方向呈20°角，使用3 mm打擊帽精確打擊右側大腦皮質以造成彌漫性軸索損傷。實驗組的打擊參數(shù)為(AP：-2.5 mm R：2.5 mm H：3 mm)，打擊速率均為5 m/s，打擊最低點持續(xù)時間均為200 ms。TBI后處理創(chuàng)口徹底止血，縫合頭皮。sham組僅磨除顱骨，不進行打擊操作。

1.2.2 PDH抑制劑干預 大鼠造模后PHD抑制劑組給予15 mg/kg腹腔注射[14]，1次/d，連續(xù)3 d。sham組和TBI組分別注射等體積的生理鹽水。

1.2.3 Western blot法檢測大鼠海馬組織淀粉樣蛋白β1-42(β-amyloid peptide1-42，Aβ1-42)、tau、HIF-1α、促血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)用BCA蛋白質測定試劑盒評估蛋白質濃度。使用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質并轉移至聚偏二氟乙烯膜。用含0.1%牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在室溫下將膜封閉1h，然后PBST洗滌后與PBST中的下一級抗體溫育過夜：兔抗Aβ1-42(1∶1000)，兔抗tau(1∶1000)，兔抗tau(1∶1000)，兔抗HIF-1α(1∶1000)，兔抗VEGF(1∶1000)，兔抗EPO(1∶1000)，兔抗β-Tubulin(1∶1000)。將膜與山羊抗兔二抗(1∶2000)在室溫下孵育1h。使用增強的化學發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測免疫反應性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將腦組織進行抗原修復蛋白酶K(Roche)30 min，然后用PBS洗滌3次。根據(jù)分析試劑盒使用說明書進行TUNEL溶液制備和染色。兩名觀察者使用倒置熒光顯微鏡在400×放大率下獲得CA1區(qū)段細胞定量。細胞凋亡(%)等于陽性細胞數(shù)/(陽性細胞+陰性細胞)×100%。

1.2.5 大鼠Morris水迷宮試驗 水迷宮體直徑120 cm，高35 cm。內壁涂黑，宮體內充滿自來水，水溫保持在25±2 ℃。逃生平臺直徑10 cm，高30 cm，置于宮體內坐標位置的第一象限，且低于水面0.5 cm。將自由活動的大鼠分別從四個象限隨機放入水中，讓其在逃生中尋找隱藏平臺。大鼠的活動通過水池上方固定的攝像頭進行圖像采集并用Ethovision3.0軟件進行處理。試驗包括尋找水下平臺的定位航行和去除平臺后的空間探索兩部分，主要觀察指標有：(1)定位航行試驗大鼠從31 d開始連續(xù)5 d從各個象限找到平臺的時間，記錄為平均逃避潛伏期；(2)空間探索試驗在36 d，撤掉平臺，從第Ⅱ象限入水，記錄50 s內大鼠在目標象限內游泳時間和穿越目標平臺象限次數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計處理 采用Graphpad Prism 5.0和SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)。組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PHD抑制劑提高TBI大鼠海馬組織HIF-1α表達水平 與sham組相比，TBI組HIF-1α水平明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與TBI組比，PHD抑制劑組HIF-1α水平明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。結果表明PHD抑制劑可使TBI模型大鼠腦組織中HIF-1α的水平升高(見表1、圖1)。

2.2 提高HIF-1α表達促進海馬組織VEGF、EPO表達水平 與sham組相比，TBI組VEGF、EPO水平明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與TBI組比，PHD抑制劑組VEGF、EPO水平明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。結果表明提高HIF-1α水平可使TBI模型大鼠腦組織中VEGF、EPO的水平升高(見表2、圖2)。

表1 各組大鼠海馬組織HIF-1α蛋白相對含量

注：TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

TBI組與sham組相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

圖1 PHD抑制劑促進海馬組織HIF-1α表達水平

表2 各組大鼠海馬組織VEGF、EPO蛋白相對含量

注：TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

2.3 提高HIF-1α表達抑制海馬組織Aβ1-42、tau表達水平 與sham組相比，TBI組Aβ1-42、tau水平明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與TBI組比，PHD抑制劑組Aβ1-42、tau水平明顯降低(P<0.01)。結果表明PHD抑制劑可抑制TBI模型大鼠腦組織中Aβ1-42、tau水平表達水平(見表3、圖3)。

2.4 HIF-1α減少TBI后神經(jīng)細胞凋亡 與sham組相比，TBI組細胞凋亡比率明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與TBI組相比，PHD抑制劑組細胞凋亡比率明顯降低(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。結果表明提高HIF-1α水平抑制TBI模型大鼠海馬組織早期神經(jīng)細胞凋亡(見圖4)。

表3 各組大鼠海馬組織tau、Aβ1-42蛋白相對含量

注：TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

2.5 HIF-1α改善大鼠神經(jīng)功能

2.5.1 縮短TBI大鼠逃避潛伏期 在5 d時的定位航行的實驗中，與sham組相比，TBI組大鼠的逃避潛伏顯著延長(P<0.01)；與TBI組相比，PHD組的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01)(見表4、圖5)。

2.5.2 縮短TBI大鼠在目標象限內游泳時間和穿越目標平臺象限次數(shù) 與sham組相比，TBI組大鼠在目標象限內游泳時間及跨越隱匿平臺的次數(shù)顯著減少(P<0.01)，與TBI組相比，PHD組在目標象限內游泳時間及跨越隱匿平臺的次數(shù)顯著增加(P<0.01)(見表5、圖6)。

表4 各組大鼠逃避潛伏期

注：TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

TBI組與sham相比a：P<0.01；PHD抑制劑組與TBI組相比b：P<0.01

圖5 各組大鼠逃避潛伏期

表5 各組大鼠在目標象限內游泳時間和穿越目標平臺象限次數(shù)

注：與sham相比a：P<0.01；與TBI組相比b：P<0.01

與sham組相比a：P<0.01；與TBI組相比b：P<0.01

圖6 各組大鼠在目標象限內游泳時間和穿越目標平臺象限次數(shù)

3 討 論

TBI導致的缺血缺氧性改變是TBI后認知功能障礙的誘因。缺氧是運動神經(jīng)元死亡的主要原因，已在各種神經(jīng)退行性疾病中得到證實。這種效應歸因于缺乏葡萄糖和氧氣難以滿足運動神經(jīng)元的能量需求[15]。根據(jù)Schubert等的研究，Aβ參與星形膠質細胞活化與HIF-1α表達的長期下降有關[16]。為此，本研究通過提高HIF-1α的表達水平初步探索其對認知功能障礙的影響及其機制。

最近的體外和體內研究證明了HIF-1α對Aβ誘導的海馬細胞凋亡的改善作用，HIF-1和HIF-2均被發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的大腦缺氧缺血損傷的急性和晚期階段作為保護劑[17]。Liu等研究表明認知功能障礙患者的腦HIF-1α水平降低與葡萄糖轉運蛋白-1和葡萄糖轉運蛋白-3的下調相關，HIF-1α水平降低損害葡萄糖攝取和代謝，最終導致O-乙酰氨基葡萄糖降低和tau的進一步過度磷酸化[18]。這一研究結果也得到了Deng等的進一步證實[19]。并且在本研究的結果中(見圖2)也證實了提高HIF-1α水平能有效抑制tau及Aβ1-42的水平。

Aβ積聚和低灌注可能引起VEGF的上調[20]，而VEGF誘導的血管生成可以增加運動神經(jīng)元的血液供應，這一點從使用帶有突變型超氧化物歧化酶的腺病毒載體的研究中可見證實[21]。Lunn等表明VEGF可以增加軸突生長，促進神經(jīng)發(fā)生，抑制caspase-3誘導的細胞凋亡，這種作用是通過PI3K/Akt信號傳導介導的[22]。此外，VEGF的過度表達可導致微血管的形成，從而延緩小鼠神經(jīng)元的死亡[23]。除此之外，EPO也可以介導神經(jīng)保護作用。重組人EPO能夠預防運動神經(jīng)元炎癥和凋亡[24]。其機制是通過介導腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的形成；促進抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-XL表達[25]。這在本研究中的蛋白免疫印跡實驗及熒光TUNEL實驗中得到了證實，提高HIF-1α水平促進VEGF和EPO的表達水平(見圖1)，有效抑制TBI后神經(jīng)細胞的凋亡(見圖3)，從分子水平上為大鼠TBI后神經(jīng)功能恢復提供了有力的依據(jù)。并且大鼠的Morris水迷宮試驗同樣支持提高HIF-1α水平有效改善TBI大鼠記憶功能這一論斷(見圖4、圖5)。

大鼠TBI與認知功能障礙的發(fā)生有直接關系。而提高HIF-1α水平可以有效的減少TBI引起的Aβ1-42和tau蛋白水平的升高，為預防和治療TBI后認知功能障礙提供了新的思路。因此，我們推斷提高HIF-1α水平對大鼠TBI后認知功能障礙可起到有效的預防和治療作用。