微壓香氧預(yù)處理對MCAO大鼠Apaf-1表達(dá)的影響

陳 莎，曹珺菲，徐金勇，李光武

腦卒中嚴(yán)重危害人類的生命健康，具有極高的發(fā)病率、致殘率和較高的復(fù)發(fā)率、致死率[1]，這與人們的生活方式和臨床治療、康復(fù)效果不理想有很大關(guān)系。研究大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，就是致力于尋找更為有效的方法，以減少腦卒中的危害。再灌注，即腦血流的恢復(fù)，這一過程中產(chǎn)生大量的氧自由基，使線粒體損傷，引起細(xì)胞大量凋亡，腦損傷進(jìn)一步加劇，也就是所謂的“再灌注損傷”[2]。腦耗氧占人體總耗氧量的20%～30%，在發(fā)生缺血的同時也造成組織缺氧，組織的缺氧是引起細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素[3]。氧是幫助物質(zhì)代謝的，它本身不是能量物質(zhì)。因此提高腦組織供氧對缺血性腦卒中有治療作用。高壓氧預(yù)處理對卒中動物模型能產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。臨床上已將高壓氧療作為缺血性腦血管病治療的一種手段。但是，高壓氧治療有很多副作用，如氣壓傷、減壓病、氧中毒等，以及高壓氧艙有限的利用性和患者的依從性[5]，使得高壓氧用于治療卒中受到了很多限制。

MHBO-AT是一個全新的康復(fù)手段，它把氧氣療法與芳香療法結(jié)合在一起，從而形成臨床新的干預(yù)療法。其中，微壓氧(Micro-Hyperbaric Oxygen，MHBO)現(xiàn)應(yīng)用于緩解高原反應(yīng)、康復(fù)治療等領(lǐng)域，芳香療法現(xiàn)應(yīng)用于調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能、營養(yǎng)神經(jīng)等領(lǐng)域[6]。氧艙利用分子篩制氧，艙內(nèi)增加1.3倍大氣壓，制氧濃度93%±3%，制氧流量3～5 L/min，實際吸入氧濃度約50%。它利用壓力提供動力，利用氧氣幫助提供能量，能增加血漿中的溶解氧含量，增加氧的彌散半徑，從而增加組織供氧，清除ROS水平，維持缺血組織處線粒體的功能，減少缺血處組織的損傷[7]。芳香療法是一種古老的自然療法，通過吸入、沐浴或按摩將精油作用于人體，屬于替代醫(yī)學(xué)的一種[6]。精油是從芳香植物中蒸餾萃取出來的，是分子量很小的活性混合物，它含有多種化學(xué)成分，可以通過嗅覺產(chǎn)生藥理作用，具有多靶點、高生物活性、高滲透性、高揮發(fā)性、人體相容性等生物學(xué)特性[8]。以前的研究表明，精油對神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用[9]。本實驗通過將氧氣療法與芳香療法聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)合腦缺血再灌注損傷模型，采用TTC染色、免疫組織化學(xué)法、Western blot等，探討MHBO-AT預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的干預(yù)作用及其可能的機制，為缺血性腦卒中的預(yù)防打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性成年SD大鼠，85只，體重量220～250 g，鼠齡2～3 m，由安徽省實驗動物中心提供。分籠喂養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境3 d，自由飲水和進(jìn)食，環(huán)境溫度22～25 ℃，濕度50%，光暗周期12 h。

1.2 儀器和試劑 微壓氧艙(上海氧知元醫(yī)療科技有限公司)，YSJ-SD自動組織脫水機(常州中威電子儀器有限公司)，YD-6L生物組織石蠟包埋機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)，RM-2135石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司)，DM6 B正置智能顯微鏡(上海徠卡儀器有限公司)，JY92-11D超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)，Legend Micro 17R微量離心機(Thermo)，DYY-7C電泳儀(北京市六一儀器廠)，EPSON V600 Photo掃描儀(愛普生中國有限公司)等。迷迭香精油(安徽澳德瑞生物科技有限公司)，兔多克隆抗體Apaf-1(Abcam)，免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，β-actin(proteintech)，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)(Sigma)。

1.3 模型制備 采用改良的線栓法制作模型[10]：大鼠在術(shù)前禁食12 h，不禁水，取大鼠稱重，用7%水合氯醛(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈，分離出頸內(nèi)動脈、頸外動脈，采用從頸總動脈向頸內(nèi)動脈進(jìn)線的方法，插入魚線(線頭端蘸硅膠)至大腦中動脈，縫合切口，消毒頸部皮膚，單籠放置。2 h再灌注，拔線栓，不要把魚線全部拔出，以免出血。大鼠出現(xiàn)前爪內(nèi)收和(或)眼睛horner征，則是模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組，線栓只插入距頸總動脈分叉處6 mm處，不阻斷大腦中動脈，其余同模型組。

1.4 實驗分組及干預(yù)方法 將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、微壓香氧預(yù)處理組，假手術(shù)組15只，模型組和微壓香氧預(yù)處理組每組35只，除假手術(shù)組外其余各組根據(jù)再灌注后時間點不同又分為6 h、12 h、24 h 3個亞組，6 h、12 h每組10只，24 h組15只。微壓香氧預(yù)處理組術(shù)前14 d，每天進(jìn)行一次MHBO-AT干預(yù)45 min。具體方法如下：把SD大鼠放入一長寬高約為50 cm的方形的實驗桶內(nèi)，實驗桶放到氧艙里，用濕化瓶把精油和氧結(jié)合到一起，流量計控制氧的流速為3 L/min，濕化瓶里滴入精油6 滴/10 只大鼠，加蒸餾水至8 ml，使桶內(nèi)的大鼠以吸嗅方式吸入香氧。模型組和假手術(shù)組不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5 TTC染色 每組取5只大鼠用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)進(jìn)行腹腔深度麻醉，開胸充分暴露心臟，在心尖部插入灌注針頭，剪開右心耳，用生理鹽水灌注至肝臟顏色發(fā)白。取腦，-20 ℃冰箱中速凍20 min，均勻切取腦片5片。將腦片置于TTC染色液中，放入37 ℃溫箱15～30 min，觀察腦組織顏色變化，正常腦組織呈紅色，缺血組織呈蒼白色。把腦片按腦解剖順序重新排列，用掃描儀將正反面掃描后輸入電腦，用Image J圖像分析軟件計算每片腦片梗死灶面積和腦片面積。梗死灶體積=[(各片正面梗死面積之和+各片反面梗死面積之和)/2]×每片厚度。同樣方法計算出全腦體積。腦梗死體積百分比=(梗死灶體積/全腦體積)×100%。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測梨形皮質(zhì)Apaf-1蛋白表達(dá) 每組于再灌注后6 h、12 h、24 h隨機取5只大鼠，動物用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉后，先用生理鹽水灌注心臟，再用4%多聚甲醛灌注，迅速取腦，切取右側(cè)大腦半球，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋，連續(xù)腦組織冠狀切片(3 μm)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，常規(guī)脫蠟至水，采用SP法檢測Apaf-1表達(dá)，具體操作步驟按照常規(guī)操作進(jìn)行。兔多克隆抗體Apaf-1按1∶60稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃過夜加二抗，新鮮配置的DAB液顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，烘干，鏡下觀察結(jié)果，用Image J圖像分析軟件分析。

1.7 Western blot法檢測梨形皮質(zhì)Apaf-1蛋白含量 每組取5只SD大鼠，斷頭取腦后置于冰上迅速分離右側(cè)梨形皮質(zhì)，-80 ℃速凍保存。取出冰凍的腦梨形皮質(zhì)稱重50 mg，經(jīng)裂解液裂解、冰凍離心機離心后提取總蛋白，根據(jù)其蛋白濃度(BCA法測定)配平使各樣本蛋白等量，取30 μg蛋白樣品，用6%分離膠分離，分離的蛋白采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min后，分別加入1∶1000兔多克隆抗體Apaf-1，4 ℃冰箱中孵育過夜。用TBST漂洗3次，每次10 min，加入二抗(1∶5000)，室溫緩慢搖動1～2 h，TBST漂洗3次，顯影，顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用(A液∶B液=1∶1)，放于顯影儀成像并掃描，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值表示待測蛋白含量。

2 結(jié) 果

2.1 TTC染色結(jié)果 大鼠腦缺血再灌注后都出現(xiàn)了不同程度的梗死灶，與模型組比較，微壓香氧預(yù)處理組梗死體積明顯縮小，差異有顯著性(P<0.05)(見圖1)。

圖1 TTC染色顯示大鼠腦組織梗死灶大小。Sham：假手術(shù)組；I/R：模型組；I/R+MHBO-AT：微壓香氧預(yù)處理組。1A：TTC染色圖片。1B：各組腦梗死體積比(mean±SD，n=5)，***P<0.01，*P<0.05 VS模型組

2.2 微壓香氧預(yù)處理對腦缺血再灌注大鼠腦梨形皮質(zhì)Apaf-1蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果顯示，Apaf-1蛋白表達(dá)陽性反應(yīng)為神經(jīng)細(xì)胞胞漿呈棕黃色。假手術(shù)組大鼠腦梨形皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，有少量細(xì)胞胞漿黃染；模型組大鼠腦梨形皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列不規(guī)整，細(xì)胞胞體縮小，有的核固縮，大量細(xì)胞胞漿黃染；微壓香氧預(yù)處理組大鼠腦梨形皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較模型組有很大的改善，有輕微核固縮，神經(jīng)細(xì)胞胞漿部分黃染。與假手術(shù)組相比，模型組各時點Apaf-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均增高(P<0.01)；與模型組相比，微壓香氧預(yù)處理組各時點Apaf-1蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.05)(見圖2)。

圖2 免疫組化測定Apaf-1蛋白表達(dá)。A：假手術(shù)組(SP×50)；B：假手術(shù)組(SP×400)；C、D、E：模型組6 h、12 h、24 h(SP×400)；F、G、H：微壓香氧預(yù)處理組6 h、12 h、24 h(SP×400)；I：各組Apaf-1蛋白陽性細(xì)胞數(shù)(mean±SD，n=5)，Sham：假手術(shù)組；I/R：模型組；I/R+MHBO-AT：微壓香氧預(yù)處理組。***P<0.01，*P<0.05 VS模型組

Western blot結(jié)果顯示，模型組各時點Apaf-1蛋白平均灰度值均較假手術(shù)組增高(P<0.01)；與模型組相比，微壓香氧預(yù)處理組的各時點Apaf-1蛋白灰度值均明顯降低(P<0.05)(見圖3)。

3 討 論

本實驗中，第一次把氧氣療法與芳香療法結(jié)合使用，證明了MHBO-AT預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。圖1TTC染色結(jié)果顯示微壓香氧預(yù)處理組中腦梗死體積明顯縮小，缺血半暗區(qū)幾乎沒有梗死灶。圖2、圖3顯示，Apaf-1蛋白表達(dá)水平從6 h～24 h依次增強，微壓香氧預(yù)處理組中蛋白表達(dá)水平低于模型組。

大腦動脈血流阻斷時，引起腦組織缺血及缺氧，缺血缺氧環(huán)境使蛋白質(zhì)和脂質(zhì)變性、線粒體功能障礙[3]。而再灌注過程中，線粒體因功能發(fā)生障礙，使電子傳遞鏈中氧分子供應(yīng)不足，導(dǎo)致大量的ROS產(chǎn)生[11]，ROS對細(xì)胞器和細(xì)胞造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡。過多的ROS又能引起線粒體損傷，使線粒體膜通透性發(fā)生改變[12]。線粒體作為細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，構(gòu)成了凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。腦缺血再灌注損失后，線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞漿后在ATP的協(xié)同作用下與凋亡酶激活因子1(Apoptotic protease-activating factor 1，Apaf-1)結(jié)合，以使其分子結(jié)構(gòu)改變來激活caspase-9前體，形成凋亡體，并進(jìn)一步激活其下游caspase-3等酶系列，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。內(nèi)源性Apaf-1是一種可溶蛋白，分子量130 kDa，具有顆粒狀的胞質(zhì)分布[14]。在細(xì)胞漿中與細(xì)胞色素C結(jié)合，參與線粒體凋亡途徑，是凋亡體的核心。Apaf-1蛋白表達(dá)升高促進(jìn)了神經(jīng)元的凋亡，是腦缺血再灌注損傷的發(fā)生機制之一[15]，這可能成為預(yù)防該類疾病新的分子靶點，為探索預(yù)防該類疾病的方法開辟了新的研究方向。

圖3 Western blot測定Apaf-1蛋白表達(dá)(mean±SD，n=5)，Sham：假手術(shù)組；I/R：模型組；I/R+MHBO-AT：微壓香氧預(yù)處理組。A：各組6 h、12 h、24 h蛋白表達(dá)條帶；B：各組6 h、12 h、24 h Apaf-1/β-actin蛋白表達(dá)相對灰度值。***P<0.01，*P<0.05 VS 模型組

眾所周知氧與線粒體之間密不可分的聯(lián)系，線粒體是產(chǎn)生能量的主要場所，而氧是幫助產(chǎn)生能量的。當(dāng)線粒體功能障礙時，氧氣療法能幫助恢復(fù)線粒體功能而且不會增加ROS水平[16]。MHBO-AT利用壓力把氧氣輸送到缺血水腫處的組織中、氧增加組織的彌散半徑，使精油分子更好的通過嗅覺通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。迷迭香精油是從迷迭香植物的葉、花、莖中提取的芳香開竅類物質(zhì)，主要成分有迷迭香酸、迷迭香酚、黃酮、黃酮苷、蒎烯、桉葉素、樟腦等，可以刺激嗅覺，在大腦中減少脂質(zhì)過氧化、抑制ROS生成[17]。李健等研究發(fā)現(xiàn)迷迭香吸入對腦卒中后抑郁樣行為有明顯的改善，可能與氣味信號作用于情緒環(huán)路有關(guān)[18]?？梢娒缘憔驮诒Ｗo(hù)缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

嗅覺傳導(dǎo)通路，精油分子作用起效快、生物利用度高，避免了胃腸道反應(yīng)及首關(guān)消除。精油分子由嗅感覺細(xì)胞接受氣味信息，產(chǎn)生動作電位傳遞到嗅神經(jīng)，通過嗅球的整合以嗅束的方式投射到嗅皮質(zhì)的前嗅核、嗅結(jié)節(jié)、梨形皮質(zhì)及部分內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)，再到次級皮質(zhì)中樞，產(chǎn)生藥理作用[19]。其中梨形皮質(zhì)是哺乳動物處理嗅覺信息的主要部位，是處理嗅覺信息過程中到達(dá)的初級皮質(zhì)，是感知氣味至關(guān)重要的舊皮質(zhì)。因此，觀察大鼠腦梨形皮質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞蛋白的表達(dá)能夠說明MHBO-AT是否對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。免疫組化和WB結(jié)果均說明微壓香氧預(yù)處理組蛋白表達(dá)比模型組降低。由此可以得出，MHBO-AT預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，通過抑制腦梨形皮質(zhì)中Apaf-1蛋白的表達(dá)可能是其作用機制，能預(yù)防腦卒中的發(fā)生。MHBO-AT在使用上強調(diào)一種時效關(guān)系，下一步將把研究重點放在MHBO-AT干預(yù)缺血再灌注損傷的最佳有效劑量上。