Bag-1和P53蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)與術(shù)后效果的關(guān)系

呂金鋒 裴繼花 王曉明

焦作煤業(yè)(集團(tuán))中央醫(yī)院 1 普外科 2 耳鼻喉科，河南省焦作市 454150

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌中發(fā)生率最高的病理類型，具有組織分化程度好、惡性程度低的特點(diǎn)；但仍有30%～50%高分化PTC患者早期可發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā)[1]。惡性腫瘤的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移特性往往與凋亡機(jī)制障礙有關(guān)。Bag-1(Bcl-2-associated athanogene 1)是新近發(fā)現(xiàn)與膀胱癌、胃癌、白血病等多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的基因，作為一種重要的腫瘤凋亡抑制基因，其表達(dá)上調(diào)可能參與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[2-3]。但也有研究認(rèn)為[4]，其表達(dá)增加可預(yù)測較好的臨床結(jié)局。此外，P53作為一種重要的抑癌基因，其表達(dá)失活或突變可誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[5]。基于此，該研究旨在分析Bag-1和P53相關(guān)表達(dá)蛋白在PTC中的表達(dá)與術(shù)后效果的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象資料 選擇2014年1月—2016年10月我院診斷的PTC患者96例，手術(shù)切除腫瘤組織和癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70歲；(2)病理證實(shí)為PTC，未行手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌等治療；(3)能獲得完整病灶組織；(4)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠、哺乳期婦女；(2)其他部位原發(fā)惡性腫瘤，嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病；(3)同時參與其他研究，失隨訪等。其中男30例，女66例，年齡38～66歲，平均年齡(48.7±9.2)歲，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期63例，Ⅲ～Ⅳ期33例，腫瘤最大徑1.5～4.8cm，平均最大徑(2.9±1.2)cm，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。

1.2 研究方法 采用免疫組織化學(xué)染色法比較Bag-1和P53蛋白的陽性表達(dá)率；采用Western blot法檢測Bag-1和P53蛋白定量水平；分析Bag-1和P53蛋白表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系。采用根治性腫瘤切除和淋巴結(jié)清掃治療，隨訪時間10.0～45.0個月，中位時間30.0個月，比較Bag-1和P53蛋白陽性與陰性表達(dá)患者的無疾病進(jìn)展時間(PFS)、復(fù)發(fā)率和總生存率。

1.2.1 免疫組化法：常規(guī)制作組織切片，厚度5μm，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，加入3% H2O2溶液27℃孵育 20min，滴加正常山羊血清工作液，27℃孵育30min；滴加鼠抗人Bag-1和P53單克隆抗體一抗(江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1∶2 000)，置于濕盒內(nèi) 4℃孵育過夜，以正常小鼠 IgG 代替一抗作為陰性對照；滴加兔抗鼠IgG多克隆抗體二抗(江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1∶500)，置于濕盒中27℃孵育20min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(江蘇碧云天科技有限公司)，置于濕盒中27℃孵育20min，PBS振蕩洗滌5min×3次；DAB顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、室溫晾干、光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：采用半定量法，依據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比率；以胞漿或胞核黃染至深棕色為陽性，染色強(qiáng)度中無陽性染色為0分，弱染色為1 分，中等強(qiáng)度染色為2分，強(qiáng)染色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)比率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；兩項(xiàng)乘積0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.2.2 Western blot法：組織勻漿后加RIPA裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行粗定量，每次檢測蛋白前使用β-actin抗體對各樣本的蛋白量進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化檢測。取30μg總蛋白，8%SDS-PAGE電泳分離，將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加鼠抗VEGF和p38-MAPK單克隆抗體(1∶2 000，美國sigma 公司)靜置過夜，加兔抗鼠多克隆抗體二抗(1∶500，美國sigma 公司)室溫孵育4h，PBS洗滌，ECL顯色。結(jié)果掃描保存，Lab Works4.5凝膠成像軟件(美國Invitrogen 公司)行半定量分析，以積分光密度(IOD)表示。

2 結(jié)果

2.1 Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)率的比較 癌組織Bag-1和P53蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)率的比較[n(%)]

2.2 Bag-1和P53蛋白定量水平的比較 癌組織Bag-1和P53蛋白相對表達(dá)水平也明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 Bag-1和P53蛋白定量水平的比較

2.3 Bag-1和P53蛋白表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系 女性、腫瘤最大徑和TNM分期增加以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中Bag-1和P53蛋白的陽性表達(dá)率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 Bag-1和P53蛋白表達(dá)與腫瘤臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系 Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)者的PFS明顯縮短，復(fù)發(fā)率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)與生存預(yù)后的關(guān)系

3 討論

李振想等[6]研究指出，Bag-1蛋白在PTC組織中過表達(dá)可能與腫瘤發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。Bag-1蛋白在正常甲狀腺組織中幾乎不表達(dá)，作為一種多功能結(jié)合蛋白，可與酪氨酸激酶生長因子受體、血小板衍生生長因子等結(jié)合，發(fā)揮抑制凋亡作用；還可與Hsp70、孕激素受體等多種信號因子相結(jié)合，調(diào)控多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[7-8]。Bag-1與Bcl-2形成復(fù)合物后抗細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，還可上調(diào) Bcl-2的抗凋亡能力[9]。朱斌[10]研究證實(shí)，P53 蛋白陽性表達(dá)與PTC的病理分級相關(guān)，過度表達(dá)可能預(yù)示較差的臨床預(yù)后。Bcl-2和P53均是真核生物體內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞凋亡的重要分子。

通過該研究得出：癌組織Bag-1和P53蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。癌組織Bag-1和P53蛋白相對表達(dá)水平也明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表達(dá)與PTC的發(fā)生有關(guān)。Bag-1基因位于9p12號染色體，主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能，具有4種亞型。通過設(shè)計(jì)針對Bag-1的阻斷性抗體免疫治療或反義核酸基因，或者是基因轉(zhuǎn)染和特異性小干擾RNA技術(shù)構(gòu)建基因沉默體系，封閉Bag-1基因的表達(dá)，可加速腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，為腫瘤的靶向治療提供重要思路[11-12]。女性、腫瘤最大徑和TNM分期增加，以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中Bag-1和P53蛋白的陽性表達(dá)率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表達(dá)參與PTC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等行為。PTC的發(fā)生與雌激素的分泌及受體功能密切相關(guān)，也可能是Bag-1和P53蛋白表達(dá)增加的重要機(jī)制[13]。進(jìn)一步隨訪發(fā)現(xiàn)，Bag-1和P53蛋白陽性表達(dá)者的PFS明顯縮短，復(fù)發(fā)率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示Bag-1和P53蛋白表達(dá)可預(yù)測腫瘤的臨床結(jié)局[14]。

綜上所述，Bag-1和P53蛋白在PTC中表達(dá)上調(diào)與腫瘤臨床特征和術(shù)后生存結(jié)局密切相關(guān)，Bag-1和P53蛋白可能成為早期診斷、評估治療和生存預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。研究不足是樣本量較小，隨訪時間較短，因此，結(jié)果還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。