丹酚酸B誘導(dǎo)血管新生和緩解氧化應(yīng)激對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用①

呂 娟 趙紅梅 孫桂芳 王潤青

(鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

腦卒中是腦部血管破裂或血管柱塞導(dǎo)致腦損傷的一種急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率[1]。2015年的調(diào)查報告顯示，全球約有4 000 萬腦卒中患者，造成600萬人死亡，是僅次于冠狀動脈的第二大致死疾病[2]。目前治療手段主要有抗血小板、靜脈溶栓、動脈溶栓和取栓，血管成形和支架植入[3]。許多實驗證明神經(jīng)保護(hù)劑、抗氧化劑通過對抗活性氧或抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，減少由缺血引起的組織損傷，然而到臨床期，所有的藥物都宣告失敗[4]。丹參是著名的傳統(tǒng)中藥材，廣泛地應(yīng)用于治療各種心血管疾病[5]。丹參的主要有效水溶性成分是丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)和二羥基苯基乳酸[6]。研究顯示，丹酚酸B能減弱白細(xì)胞對肝竇性的黏附性，抑制嗜中性內(nèi)皮細(xì)胞黏附，抑制內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecular 1，ICAM-1)的表達(dá)[7]。丹酚酸B通過抑制核因子b的激活，減弱了內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和血管細(xì)胞黏附分子1的表達(dá)[8]。另外許多研究證實，丹酚酸在氧化應(yīng)激和癌癥治療方面發(fā)揮作用[9,10]。但是丹酚酸B對腦缺血再灌注的影響還鮮有研究。本文將探究丹酚酸B對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 丹酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(115939-25-8)購自源葉生物；SD大鼠購自廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心；HE染色試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天；總超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧生物；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和乳酸脫氫酶(Lactate dehyderogenase，LDH)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物；免疫組化SP試劑盒購自默沙克生物；Ripa裂解液購自索萊寶生物科技公司；ICAM-1、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、VEGFR2、P38、p-P38、p-熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)27兔抗大鼠一抗購自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗及DAB顯色液購自上海羽朵生物。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠分組及模型建立 SD大鼠實驗前，適應(yīng)環(huán)境一周。將40只SD大鼠分成4組：健康組(Ctrl)；加藥組：健康大鼠腹腔注射丹酚酸B 50 mg/kg體重；模型組：參考文獻(xiàn)建立局灶性腦缺血再灌注(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型；模型加藥組：模型大鼠腹腔注射丹酚酸 B 50 mg/kg體重。加藥組和模型加藥組大鼠在建模前3 d 腹腔注射給藥，每天1次，再灌注2 h時再次給藥；健康組和模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水；大鼠在再灌注24 h后處死。根據(jù)Longa提出的可逆性大腦中動脈閉塞線栓法制作局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸正中切口暴露頸總動脈、頸外動脈和翼腭動脈，將單絲尼龍線由頸總動脈插入，栓塞左側(cè)大腦中動脈，缺血2 h后，取出尼龍線，24 h再灌注。模型成功的標(biāo)志是大鼠右側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)。

1.2.2HE染色 大鼠用4%的多聚甲醛灌注后取腦，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)方法石蠟包埋，切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫，最后加入蒸餾水。蘇木素溶液處理5 min，自來水洗，70%和90%乙醇脫水各10 min，酒精伊紅染色液染色3 min；切片經(jīng)無水乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后，中性樹膠封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3TUNEL染色 常規(guī)方法石蠟包埋、脫蠟、至水。切片用二甲苯處理后，梯度乙醇洗脫，加蛋白酶K 室溫水解15 min，蒸餾水洗。加含2%過氧化氫的PBS室溫處理5 min，PBS清洗；加TDT酶反應(yīng)液，濕盒中反應(yīng)1 h；加反應(yīng)終止液，PBS清洗，加過氧化物酶標(biāo)記的抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；二甲苯脫水，封片，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4免疫組化 石蠟切片用3%乙酸滅活內(nèi)源性酶，高溫加熱修復(fù)抗原；加山羊血清封閉，加PBS稀釋好的抗體，37℃孵育2 h,PBS清洗后，加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min；DAB顯色；用含1%的Tween 20的PBS清洗；蘇木素復(fù)染，加堿性緩沖液返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。使用軟件Image J分析ICAM-1陽性細(xì)胞的面積，計算陽性細(xì)胞的百分比。

1.2.5Western blot 取組織細(xì)胞至含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液中，4℃下處理1 h，離心取上清。用BCA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液制作蛋白樣品。同等量的蛋白樣品用12%的變性蛋白凝膠分離，轉(zhuǎn)膜，5%BSA的封閉液常溫封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min；加二抗室溫下孵育2 h，TBST洗膜后，加顯色液，凝膠成像儀中觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0處理實驗數(shù)據(jù)，多組間比較使用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹酚酸B緩解局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織的損傷 加藥組與健康組相比，MCAO大鼠腦組織沒有出現(xiàn)明顯變化，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，核仁清晰(圖1)。模型組與對照組相比，大量神經(jīng)細(xì)胞失去完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞周圍明顯腫脹，部分出現(xiàn)壞死后形成的空泡(圖1)。模型組加藥處理后，細(xì)胞排列明顯規(guī)則，層次清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1)。

2.2丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡 模型組與對照組相比較，TUNEL染色呈陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著上升(圖2，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比較，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例顯著降低(圖2，P<0.01)。

2.3丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng) 模型組與對照組相比，腦組織中SOD的活性顯著降低，MDA和LDH的含量顯著上升(圖3，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比，SOD活性顯著上升，MDA和LDH的含量顯著降低(圖3，P<0.01)。

圖1 丹酚酸B對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織病理損傷的影響Fig.1 Effect of Salvianolic acid B on pathological damage in focal cerebral ischemia reperfus-ion rats

圖2 丹酚酸B對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Salvianolic B on cell apoptosis in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

2.4丹酚酸B降低局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) 免疫組化結(jié)果顯示，模型組與對照組相比較，大鼠腦組織中ICAM-1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(圖4，P<0.01)。模型組大鼠注射丹酚酸B后，大鼠腦組織中ICAM-1的表達(dá)顯著下調(diào)(圖4，P<0.01)。

2.5丹酚酸B誘導(dǎo)MCAO大鼠腦組織損傷部位血管生成 模型組與對照組相比，大鼠腦組織VEGF及VEGFR2的表達(dá)顯著下調(diào)(圖5，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比，大鼠腦組織VEGF和VEGFR2的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5，P<0.01)。

2.6丹酚酸B促進(jìn)P38和Hsp27的磷酸化激活 Western blot 結(jié)果顯示，各組之間P38和Hsp27表達(dá)總量差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖6，P<0.01)。模型組與對照組相比較，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表達(dá)顯著下調(diào)(圖6，P<0.01)。模型加藥組與模型組相比較，磷酸化P38和磷酸化Hsp27的表達(dá)顯著上調(diào)。

圖3 丹酚酸B對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of Salvianolic B on oxidative stress response in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

圖4 丹酚酸對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Salvianolic B on expression of ICAM-1 protein in MCAO ratsNote：*.P<0.05 vs Ctrl group,#.P<0.05 vs MCAO group.

圖5 丹酚酸B對MCAO大鼠腦組織VEGF和VEGFR2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Salvianolic B on expression of VEGF and VEGFR2 in MCAO ratsNote：*.P<0.01 vs Ctrl group,#.P<0.01 vs MCAO group.

3 討論

缺血性腦卒中占中風(fēng)患者的絕大部分。腦組織缺血后，供氧中斷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)能量耗竭、乳酸堆積、內(nèi)穩(wěn)態(tài)遭破壞、神經(jīng)遞質(zhì)異常、興奮氨基酸毒性，再灌注產(chǎn)生大量氧自由基，常導(dǎo)致缺血腦組織的進(jìn)一步損傷[11]。大量研究顯示，丹酚酸B對機(jī)體損傷部位具有保護(hù)作用。如Gu等[12]研究顯示，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)ERK/P38/核因子樣蛋白2(Nuclear factor-like 2 protein，Nrf2)信號通路，減輕大鼠蜘蛛網(wǎng)膜下出血引起的早期腦組織損傷。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過對PI3K/AKT信號通路的調(diào)控，抑制氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，降低腎缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷。本文研究結(jié)果顯示，丹酚酸B能緩解局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織病變。

當(dāng)機(jī)體遭受慢性損傷或應(yīng)激時，機(jī)體可以啟動一系列的防御機(jī)制從而產(chǎn)生保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。腦缺血再灌注引起的興奮性氨基酸毒性、一氧化氮和乳酸堆積等過程都能加快細(xì)胞正常死亡的進(jìn)程[14]。大量研究表明，丹酚酸B能抑制細(xì)胞凋亡。如Tao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)和線粒體膜電位，抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠胰島素細(xì)胞INS-1自噬。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過轉(zhuǎn)化受體電位陽離子通道亞家族C成員3(Transient receptor potential cation channel,TRPC3)和TRPC6介導(dǎo)的鈣離子過載，抑制阿霉素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和心肌細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦組織細(xì)胞凋亡。

當(dāng)機(jī)體受多種內(nèi)外因刺激時，產(chǎn)生大量自由基，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，造成組織損傷。腦缺血再灌注后，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對腦組織具有保護(hù)作用[17]。SOD、MDA和LDH是常見的氧化應(yīng)激水平的檢測指標(biāo)[18]。Chen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)P53和Caspase-3信號通路，緩解氧化帶密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。另外一研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)Nrf2抑制多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，使SOD和谷胱甘肽的含量上升[20]。與前人研究一致，本研究結(jié)果表明，丹酚酸B能抑制局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

ICAM-1是一種定位于內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面的糖蛋白，在穩(wěn)定細(xì)胞間的相互作用和促進(jìn)白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要的作用[21]。正常情況下，ICAM-1低表達(dá)，當(dāng)受到細(xì)胞因子如IL-1、TNF的刺激后表達(dá)量急劇增高。激活的ICAM-1與配體結(jié)合后，通過級聯(lián)許多激酶，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[22]。研究證實，ICAM-1與蜘蛛網(wǎng)膜下出血患者二級癥狀相關(guān)，抑制ICAM-1會明顯改善這些癥狀[23]。如Xu等[24]研究顯示，丹酚酸B通過降低ICAM的表達(dá)，進(jìn)而抑制血小板活化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對腦缺血再灌注大鼠的腦組織神經(jīng)具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B能顯著降低局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織ICAM-1的高表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

VEGF與其受體分子VEGFR能提高血管通透性，增加細(xì)胞外基質(zhì)變性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)血管的生成。在胚胎發(fā)生、骨骼生長、新血管生成、損傷后新生管生長以及繞過阻塞血管的新血管形成等過程都與VEGF相關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，丹酚酸B誘導(dǎo)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織血管的新生。

P38蛋白激酶參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。P38激活后，通過調(diào)節(jié)下游蛋白的激活與表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[26]。Hsp27是熱休克蛋白家族的成員之一，受P38調(diào)控能抑制Caspase和NF-κB的活化，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而減輕組織受到的損害[18,27]。在多種應(yīng)激反應(yīng)下，Hsp27可以高表達(dá)。Zeng等[28]研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B通過調(diào)節(jié)p38介導(dǎo)的活性氧生成，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞自噬。Tang等[29]研究顯示，通過調(diào)節(jié)p38 MAPK/激活轉(zhuǎn)錄因子2(Activating transcription factor 2，ATF-2)信號通路，丹酚酸B保護(hù)人體內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激功能缺失的影響。

綜上所述，丹酚酸B能誘導(dǎo)局灶性缺血再灌注大鼠腦組織血管的新生，緩解氧化應(yīng)激對腦組織的損傷。本研究下一步計劃將探討丹酚酸B對離體神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。