不同遺傳背景腐爛莖線蟲生物學(xué)雜交體系構(gòu)建與驗(yàn)證

江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001 江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(淮陰師范學(xué)院)，江蘇 淮安 223300 江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001 江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)科技實(shí)業(yè)總公司，江蘇 淮安 223001 (江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223001)

甘薯腐爛莖線蟲病是我國農(nóng)業(yè)上的重要病害，在國內(nèi)主要分布于河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省份。其病原甘薯腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)最早在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，可導(dǎo)致馬鈴薯腐爛[1]。近年來通過掃描電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確定侵染我國甘薯的莖線蟲屬于甘薯腐爛莖線蟲[2，3]，同時(shí)通過對(duì)該線蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(rDNA-ITS區(qū))核酸序列分析發(fā)現(xiàn)，我國甘薯腐爛線蟲很可能包含2 個(gè)獨(dú)立種。宛菲等[4]研究了21 個(gè)國內(nèi)甘薯腐爛莖線蟲種群，發(fā)現(xiàn)其rDNA-ITS區(qū)存在特異性差異，分別命名為A型和B型；黃建等[5]對(duì)所研究的線蟲種群進(jìn)行了ITS區(qū)序列分析及形態(tài)測(cè)量，同樣認(rèn)為我國甘薯腐爛莖線蟲分為2個(gè)基因型。為了弄清不同遺傳背景腐爛莖線蟲群體間是否能夠進(jìn)行生物學(xué)雜交以及是否有生殖隔離的現(xiàn)象存在，對(duì)不同遺傳背景的線蟲種群生物學(xué)雜交體系進(jìn)行了構(gòu)建與驗(yàn)證，并獲得了最佳方案。

1 材料與方法

1.1 線蟲種群

供試腐爛莖線蟲群體分別來自山東沂水的DeLY群體和河南洛陽的DeYL群體。雜交組合分正反交，分別為 DeLY×DeYL和DeYL×DeLY；所用薯塊品種為蘇渝303。

1.2 幼蟲及雄蟲的準(zhǔn)備

在40×體式顯微鏡下用線蟲針挑取各線蟲種群幼蟲放在玻片上，并轉(zhuǎn)到100×顯微鏡下進(jìn)一步確認(rèn)無誤后(未見生殖器分化)，收集到凹面皿中備用。雄蟲則在40×體式顯微鏡下直接挑出。

1.3 生物學(xué)雜交試驗(yàn)

1)薯片平板雜交法 接種到薯片上，接種薯片以瓊脂糖凝膠平板法置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)20次，接種1個(gè)月后將實(shí)驗(yàn)材料挑至計(jì)數(shù)皿中，滴無菌水進(jìn)行線蟲分離并在顯微鏡下觀察有無后代產(chǎn)生。

2)薯?xiàng)l離心管雜交法 在離心管里注入20μL無菌水后將線蟲挑入其中，將打孔器打下的薯?xiàng)l用滅菌刀切下后置于離心管內(nèi)，放置于平板里在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，重復(fù)20次，接種1個(gè)月后將實(shí)驗(yàn)材料挑至計(jì)數(shù)皿中，滴無菌水進(jìn)行線蟲分離并在顯微鏡下觀察有無后代產(chǎn)生。

3)薯塊切片打孔雜交法 將薯塊縱向切去1/3，留下的部分用打孔器打孔，孔間距約3cm，在接入線蟲之前，先在每個(gè)孔里注入少許無菌水，以不溢出小孔為準(zhǔn)。將線蟲接到小孔內(nèi)(注入無菌水的目的在于接種線蟲時(shí)，便于線蟲由挑針游離到無菌水里，而不至于挑針碰到薯塊而將線蟲擠壓死)，之后將切下的部分薯塊作為天然保濕蓋蓋在處理過的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，用皮筋捆綁后平放在培養(yǎng)箱里。在儲(chǔ)藏盒內(nèi)預(yù)先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境，以利于線蟲的生長發(fā)育。

以上雜交方法如圖1所示，將某線蟲種群的1 條幼蟲與另一種群的2 條雄蟲用線蟲針接入打好洞的薯塊中，接入線蟲后用石蠟封口，同時(shí)做反交組合，25℃培養(yǎng)30d后觀察結(jié)果。雜交的每個(gè)組合重復(fù)20 次。將每次處理置于計(jì)數(shù)皿中分離觀察。

圖1 腐爛莖線蟲不同雜交方案圖示

1.4 線蟲DNA的提取

DNA提取方法參照Wang等[6]的方法進(jìn)行。用挑針挑取線蟲若干條，放入去離子水中洗滌3次，備用。在潔凈的載玻片上加8μL去離子水，挑入1 條洗過的線蟲，用解剖刀將線蟲切成2～3段，用移液槍轉(zhuǎn)入到200μL PCR反應(yīng)管中；然后分別加入1μL PCR緩沖液(10×PCR Buffer)和1μL蛋白酶K(1mg/mL)，混勻；-20℃冷凍過夜之后，65℃保溫1h，94℃滅活10min，輕度離心后上清液可直接用于PCR擴(kuò)增。

1.5 雜交后代的分子鑒定1.5.1 ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增

反應(yīng)總體積50μL：ddH2O 28.6μL，10×PCR Buffer (Mg2+)5μL，dNTP (2.5mmol/L) 2μL，上游引物 (10μmol/L) 3μL，下游引物 (10μmol/L) 3μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA 8μL。反應(yīng)條件：95℃ 3min； 95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫10min，使反應(yīng)物充分延伸。反應(yīng)結(jié)束后即可開始電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。研究采用線蟲ITS區(qū)通用引物[7,8]：P1：5’-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3’; P2：5’-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3’。引物由上海寶生物公司合成。

1.5.2 雜交后代RFLP酶切

酶切參照WenDt等[9]的方法進(jìn)行。所用3 種內(nèi)切酶為RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ。酶切反應(yīng)在200μL PCR反應(yīng)管中進(jìn)行。酶切體系10μL：PCR反應(yīng)產(chǎn)物 7μL，內(nèi)切酶(10U/μL)1μL，與內(nèi)切酶相對(duì)應(yīng)的Buffer 1μL、ddH2O 1μL。酶切反應(yīng)條件為37℃、3h。在2.0%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，應(yīng)用DPS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算平均數(shù)并進(jìn)行差異的顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛莖線蟲不同雜交方案雜交結(jié)果

DeLY(群體A)種群與DeYL(群體B)種群雜交結(jié)果詳見表1。在正反交組合中，其中“DeLY×DeYL”正交組合能產(chǎn)生F1代，而反交則不成功。3種體系中正交組合的雜交率分別為30%、20%和30%，均低于對(duì)照組DeYL×DeYL雜交率，而3個(gè)正交組合所產(chǎn)生的F1代數(shù)量分別為6.17、8.25條和14.33條，與對(duì)照親本后代數(shù)相比顯著降低，均在P<0.05水平上差異顯著，表現(xiàn)出不同遺傳背景線蟲雜交親和力差，F(xiàn)1代線蟲數(shù)量少。3種雜交方案均可以培養(yǎng)成功，不同的是甘薯切片接種法雜交率高，后代數(shù)量多，親本自交數(shù)量與其他2種方法相比差異顯著，同時(shí)甘薯切片法微環(huán)境更接近原始寄主狀態(tài)，操作簡便、省時(shí)省力，相比甘薯平板打孔法和薯?xiàng)l離心管雜交法，更便于線蟲在小孔內(nèi)集中，增加線蟲雜交幾率。

表1 腐爛莖線蟲不同雜交方案雜交結(jié)果

注：雜交組合中帶“*”的為對(duì)照組，同列數(shù)據(jù)后不同肩標(biāo)字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2 雜交后代的ITS-PCR-RFLP分析

對(duì)“DeLY×DeYL”雜交組合產(chǎn)生的F1代進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2(a))， “DeLY×DeYL”正交組合產(chǎn)生的F1代中ITS擴(kuò)增產(chǎn)物非特異，有雜帶出現(xiàn)，主帶約為800bp，主帶與母本較為一致。推測(cè)可能在雜交F1有不同類型遺傳分化的個(gè)體出現(xiàn)。

(a)親本與雜交后代ITS產(chǎn)物分析；泳道：1：DeLY為父本(群體A),2：DeLY×DeYL(F1代),3：DeYL為母本(群體B)。(b)～(d)分別代表父本、雜交代、母本經(jīng)Rsa Ⅰ、 Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ 3種酶酶切后的產(chǎn)物；(b)～(d)1～3的泳道代表為：1：DeLY(父本)；2：(DeLY×DeYL)F1代；3：DeYL(母本)圖2 親本與雜交后代ITS-PCR-RFLP圖譜

2.3 雜交后代ITS區(qū)限制性酶切

從圖2(b～d)ITS-RFLP分析結(jié)果顯示DeLY×DeYL的正交組合產(chǎn)生的F1代酶切片段長度在RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ 3個(gè)酶切位點(diǎn)上與親本存在明顯差異。F1代經(jīng)過RsaⅠ酶切后出現(xiàn)主帶為750bp，HaeⅢ酶切后出現(xiàn)主帶約為600bp，HinfⅠ酶切后出現(xiàn)主帶約為450bp，均不同于父本和母本，這一結(jié)論說明2個(gè)不同遺傳背景的種群在雜交代遺傳圖譜表現(xiàn)不同，同時(shí)也證實(shí)了雜交方案與體系構(gòu)建是成功的，酶切片段差異詳見圖2。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)關(guān)于腐爛莖線蟲研究報(bào)道較多，主要集中在致病力、耐寒力、侵染途徑、種群發(fā)生危害動(dòng)態(tài)及分類與防治等方面[10～12]，關(guān)于生物學(xué)雜交體系方案鮮有報(bào)道。研究比較了腐爛莖線蟲不同雜交體系的優(yōu)缺點(diǎn)并篩選了最佳的雜交方案以進(jìn)行腐爛莖線蟲的雜交學(xué)研究，建立了以“甘薯切片打孔法”為主要生物學(xué)雜交體系，該體系優(yōu)勢(shì)在于線蟲容易集中收集、薯塊密封好便于線蟲生長繁殖，同時(shí)，分子鑒定結(jié)果表明，不同遺傳背景腐爛莖線蟲的雜交后代 “DeLY×DeYL”組合表現(xiàn)出異質(zhì)性，驗(yàn)證了所構(gòu)建的雜交體系是成功的。該研究揭示了不同地理來源的具有不同遺傳背景的腐爛莖線蟲群體間雜交在后代遺傳背景上表現(xiàn)異質(zhì)性，為今后不同遺傳背景線蟲間進(jìn)行生物學(xué)雜交提供參考依據(jù)，并可為不同遺傳背景線蟲的生殖隔離研究和其他進(jìn)境檢疫性線蟲的生物學(xué)雜交提供參考。