止血祛瘀明目片在非缺血型視網膜靜脈阻塞中的作用機制研究

韓治華 ，吳沂旎 ，王芳 ，吳雪梅 ，冀璐 ，楊淑煥

中國傳統醫學認為視網膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）屬“絡損暴盲”“血癥”范疇，臨床表現為突然出現不同程度的視物障礙，眼底表現為血管周圍片狀的出血，重者可致盲。中醫對RVO的研究多認為“血瘀”“血虛”“痰瘀”是其主要證候。西醫認為RVO是以視網膜血管閉塞，進而引發視網膜缺血缺氧及網膜無灌注的一種缺血性視網膜疾病。目前認為炎癥在其致病中的作用越來越明顯。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前公認的血管生成因子及血管通透性分子。其在RVO中的作用尚不清楚。止血祛瘀明目片是由約15種中草藥組成的一種中藥制劑，其中黃苓、牡丹皮、夏枯草具有清肝明目、清熱解毒等作用。已有研究提示止血祛瘀明目片在RVO中可改善視網膜血管閉塞及缺血情況，且治療后房水中炎性因子水平顯著降低[1]。但止血祛瘀明目片如何發揮作用及其分子信號通路目前尚不清楚。本研究對RVO患者采用止血祛瘀明目片聯合卵磷脂絡合碘進行治療，深入探討其作用機制具有重要的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 一般資料

收集2014年9月—2018年5月陜西省中醫醫院眼科收治的92例非缺血型視網膜靜脈阻塞患者，因失訪脫落7例，最終納入85例符合納排標準的患者，男 39例，女 46例；年齡 40～80歲，平均（61.9±9.5）歲；病程 3～35 d，平均（10.6±4.7） d。隨機方法分為2組，治療組最終45人（45只眼），其中男 20例，女25例；年齡43～82歲，平均年齡（61.9±9.5）歲；對照組最終納入40例（40只眼），其中男19例，女 21例；年齡 25～73 歲，平均年齡（61.4±9.7）歲。病程3～35 d。兩組患者一般臨床資料間差異沒有統計學意義。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準[2-4]（1）主要癥狀及體征：①視力不同程度下降，多為單眼發病；②眼底檢查示視網膜靜脈迂曲擴張，沿病變靜脈區有視網膜出血、滲出及水腫等，可伴有視乳頭水腫充血、邊緣模糊；③眼底熒光血管造影可見靜脈充盈時間延遲，病變區熒光滲漏，毛細血管迂曲擴張，可出現無灌注區及新生血管。（2）根據阻塞程度可分為缺血型和非缺血型（表 1）。

表1 視網膜靜脈阻塞分型標準

1.2.2 瘀血傷絡，陰虛內熱證中醫辨證依據[2,5]（1）瘀血傷絡，陰虛內熱證：主癥，視物不清；次癥，目睛干澀，視物變形、頭暈耳鳴，口咽干燥；舌脈，舌暗紅，少苔，脈弦細。主癥視物不清必備，次癥2項或以上，參考舌脈即可診斷。（2）中醫癥狀評分標準見表2。

1.3 納入標準

（1）符合非缺血型視網膜中央靜脈阻塞西醫診斷標準者，且伴有黃斑水腫的患者；（2）符合中醫證候瘀血傷絡，陰虛內熱證辨證標準者；（3）發病在3個月以內的患者 （不含3個月）；（4）年齡35～75歲。

表2 中醫癥狀評分標準表

1.4 排除標準

（1）伴有角膜混濁、角膜散光等對視力有影響的眼部疾病者；（2）既往有眼部手術史及前房淺、房角窄者；（3）合并嚴重肝、腎功能不全者；（4）妊娠及哺乳期婦女；（5）過敏體質患者；（6）未簽署知情協議書者。

1.5 研究方法

1.5.1 用藥方法及所用試劑 止血祛瘀明目片(由陜西摩美得氣血和制藥有限公司生產），薄膜衣每片重0.3 g。卵磷脂絡合碘片（由日本第一藥品產業株式會社生產）1.5 mg/片。 兔抗人多克隆抗體 NF-κB（1:5000）及兔抗人單克隆抗體 VCAM-1（1:1000）均購自英國abcam公司。

1.5.2 治療方法 兩組所有患者均給予靜滴注射用血栓通300 mg/d，及神經營養劑（小牛血清去蛋白注射液）0.8 g/次，1次/d，作為基礎治療。對照組患者口服卵磷脂絡合碘片，1.5 mg/次，3次/d。治療組患者在對照組基礎上口服止血祛瘀明目片，每次5篇，每日3次。兩組患者均連續治療12周。

1.6 觀察指標

1.6.1 視力檢查 采用國際標準視力表檢查患者治療前后最佳矯正視力，以小數記錄,治療期每4周記錄1次。

1.6.2 眼底出血面積的改善 散瞳后行眼底鏡檢查及眼底照相，記錄出血部位及面積，折合成視盤直徑（PD)計算，觀察精確度至1/5 PD,治療期每4周記錄1次。比較兩組患者在治療前后變化情況。

1.6.3 中醫證候 采集患者中醫證候材料，分別于治療前、試驗4周、試驗8周、試驗12周進行采集。

1.6.4 血清VEGF、IL-6和IL8水平 采用酶聯免疫吸附實驗法檢測兩組患者治療前后血清中VEGF、IL-6和IL-8水平。分別在治療前和治療12周時抽取兩組患者血清，用雙抗夾心ELISA法檢測血清中VEGF、IL-6和IL-8的含量。

1.6.5 NF-κB及VCAM-1的蛋白表達 采用Western blot檢測，分別于治療前和治療12周時抽取兩組患者血清，用血清總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，通過SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、封閉抗體ECL化學發光，用β-actin的表達作為內參照進行比較，測定目的蛋白條帶密度灰度值與內參蛋白條帶密度灰度值的比值，即為目的蛋白相對灰度值。

1.7 療效指標

1.7.1 視力改善情況 顯效：視力提高4行及以上或達到1.0；有效：視力提高2行；無效：視力無變化或下降。注：雙眼發病者評價右眼。按照國際標準視力表1分制進行記錄；0.1以下視力增加檔次按以下方法計算：無光感、光感、手動、數指/33 cm、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1.增加 2行為有效；增加 4行及以上為顯效。

1.7.2 眼底出血療效 臨床治愈：視力恢復1.0以上，或恢復至發病前視力，眼底出血基本吸收，眼底血管熒光造影基本正常；顯效：視力提高4行以上，眼底出血量大部分吸收（1/2～2/3面積），眼底血光熒光造影明顯改善；有效：視力提高2～3行以上，眼底出血量大部分吸收（1/3～1/2面積），眼底血光熒光造影有所改善；無效：視力無變化或下降，眼底出血無變化或增多，眼底血光熒光造影無變化或惡化[6]。

1.7.3 中醫證候總積分評價標準[6]臨床痊愈：中醫證候積分減少≥95%；顯效：中醫證候積分減少≥70%；有效：中醫證候積分減少≥30%；無效：中醫證候積分減少不足30%。療效指數n=[（療前總積分-療后總積分）/療前總積分]×100%。

1.8 統計學方法

采用SPSS22.0統計分析軟件，計量資料將采用均數±標準差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t檢驗，組內治療前后比較采用配對t檢驗。兩組間等級定性資料采用Kruskal-Wallis H檢驗。統計檢驗均采用雙側檢驗，P＜0.05為檢驗有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者不同時間點視力比較

兩組患者視力水平發現治療后均比治療前顯著提高，治療組隨治療時間的延長視力逐步恢復，且治療8周后視力提高顯著，對照組視力變化趨勢同治療組，但同一時間兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。（表 3）

表3 兩組患者治療前后視力比較（xˉ±s）

2.2 眼底出血面積

眼底出血面積消退，總療效分析，治療組總有效率為80.0%，對照組總有效率為52.5%，兩組比較有統計學意義（χ2=4.370，P=0.037）。 （表 4）

表4 兩組眼底出血總療效[例數（%）]

2.3 中醫證候療效

中醫證候療效分析，治療組總有效率為84.4%，對照組總有效率為55.0%，兩組比較有統計學意義（χ2=6.403，P=0.011）。 （表 5）

表5 兩組中醫證候療效分析

2.4 兩組血清VEGF、IL-6和IL-8水平比較

兩組患者血清中VEGF、IL-6和IL-8水平檢測發現治療后均比治療前顯著降低，兩組治療前后相比差異具有統計學意義（P＜0.05），且各個指標治療組的效果顯著優于對照組，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。（表 6）

表6 兩組血清學指標比較（xˉ±s）

2.5 兩組蛋白水平比較

兩組患者血漿中NF-κB及VCAM-1蛋白水平檢測發現治療后二者的蛋白水平顯著下調，與治療前相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），且各個指標治療組的效果顯著優于對照組，且差異具有統計學意義（P＜0.05）。 （圖 1、表 7）

圖1 治療組和對照組NF-κB和VCAM-1蛋白水平治療前后比較。CG對照組；EG治療組

3 討論

血管內皮生長因子（VEGF)是目前公認的血管生成因子及血管通透性分子。其主要功能是內皮細胞增生、遷移及血管腔的形成，是一種慢性炎癥過程。Jung、Fonollosa及艾華等發現在RVO患者的房水及玻璃體中發現VEGF的明顯增高，且炎性相關因子如TNF-α、IL-6等水平也相應升高，且RVO的嚴重程度與其濃度顯著相關，因此推測炎癥可能參與VEGF誘導的視網膜新生血管的發生[7-9]。我們的研究發現RVO患者治療前血漿中的VEGF的水平顯著升高，治療后明顯下調，同時發現炎性相關因子IL-6及IL-8水平在治療后水平也明顯下降，說明VEGF及炎癥均參與了RVO的發病，同以往研究結果一致。

止血祛瘀明目片是由陜西摩美得氣血和制藥有限公司生產，該方中赤芍、墨旱蓮、大黃具有清熱、涼血止血；丹參、茺蔚子、三七具有活血通絡，祛瘀散血、消癰等作用；黃芩（酒炙）、牡丹皮、毛冬青和夏枯草具有抗炎作用，研究發現黃芩苷可顯著抑制大鼠腹腔白細胞細胞內白三烯B4、白三烯C4的生物合成，還可顯著抑制人工三肽(fMLP)激發的白細胞內Ca2+升高，并促進細胞內cAMP水平提高，表明黃芩苷顯著影響白細胞的多種功能并揭示了其抗炎的作用機理［10］。唐健青等[1]、宋麗君等[11]研究發現在 RVO中治療組 （口服止血祛瘀明目片+卵磷脂絡合碘）3個月后患者視力較對照組（口服卵磷脂絡合碘）明顯提高，且FFA顯示視網膜循環狀態恢復正常，視網膜出血顯著吸收，提示患者視網膜血管閉塞及缺血情況改善，進一步發現治療組房水中VEGF水平較治療前顯著降低，優于對照組，差異有統計學意義。我們的研究發現RVO患者治療后血漿中的VEGF和炎性相關因子IL-6及IL-8水平的水平顯著下降，且同治療前相比有統計學意義，同以往研究結果一致。然而止血祛瘀明目片如何下調VEGF、IL-6及IL-8因子其抗炎的作用機制是那些呢？

NF-κB是一個多效的轉錄因子，其受氧化應激、細胞因子等多種刺激而激活，能調控炎癥性細胞因子、轉錄因子及粘附因子，進而參與微循環障礙的發生發展。血管內皮細胞粘附分子(Ascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)主要表達于血管內皮細胞,通過白細胞粘附、跨膜運動參與血管內皮細胞功能紊亂導致血瘀癥相關疾病的發生。因此我們進一步檢測了NF-κB及VCAM-1蛋白水平，明確在RVO的發病機制及止血祛瘀明目片的作用機制。我們的研究發現，治療前NF-κB及VCAM-1的蛋白表達水平明顯增高，兩組間沒有顯著差異，而治療后NF-κB的VCAM-1蛋白表達顯著下調，且與治療前相比差異有統計學意義，提示我們止血祛瘀明目片發揮作用是通過下調NF-κB，進一步調控炎癥因子IL-6/IL-8的水平，最終影響VCAM-1的表達，進而在RVO中發揮作用的。即明確了VEGF/NF-κB/IL-6/IL-8/VCAM-1信號通路。細菌脂多糖刺激人臍靜脈內皮細胞后 4 h、8 h 發現,炎性因子 NF-κB,TNF-α,IL-6,ICAM-1,VCAM-1均顯著增加,提示細菌脂多糖通過內皮細胞表達炎性細胞因子,進而導致膿毒癥中的炎癥反應[12]，這與我們的研究結果一致。

綜上所述，止血祛瘀明目片對非缺血型視網膜靜脈阻塞具有突出療效，有擴張血管、增加血流量，改善微循環的作用，能促進側支循環的建立，有利于視功能恢復。