青島地區漢族人群PNPLA3 rs738409單核苷酸多態性與冠心病的相關性

苗夢媛 劉守勝 趙真真 徐穎譽 辛永寧 宣世英

1南京醫科大學附屬青島臨床醫學院（山東青島266011）；2青島市市立醫院中心實驗室（山東青島266071）；3青島大學（山東青島266071）；4青島市市立醫院感染科（山東青島266011）

冠心病是影響全球的主要心血管疾病之一，已被證明是發達及發展中國家死亡的主要病因［1］。遺傳因素在冠心病的發生、發展中起到了重要作用［2］。OZAKI 等［3］首次通過全基因組關聯研究（GWAS）發現細胞毒素-α基因位點與心肌梗死有關。目前為止，GWAS 已經發現了163 個冠心病遺傳易感基因［4］。進一步研究冠心病遺傳易感因素，對冠心病的早期診斷和預后具有重要意義。

PNPLA3 屬 于patatin 樣 磷 脂 酶 域（PNPLA）家族，是由481 個氨基酸組成的脂肪滋養蛋白。PNPLA3 rs738409 位點變異可降低酶的活性，阻止甘油三脂水解，導致甘油三脂的蓄積，從而影響血脂水平［5］。血脂異常與冠心病密切相關，故推測PNPLA3 rs738409 基因多態性很有可能為冠心病潛在的發病機制之一。然而國外關于PNPLA3基因多態性與冠心病的相關性研究較少，國內尚無相關報道。本文將針對PNPLA3 rs738409 位點多態性與青島地區漢族人群冠心病的關系進行探討。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本試驗遵循《赫爾辛基宣言》及其附錄的準則，獲得本院倫理委員會批準［6］。所有受試者均簽署書面知情同意書。選取2018年7月至12月青島市市立醫院收入院的199 例冠心病患者為研究對象。通過經皮冠狀動脈造影確診為冠心病，并且由兩位經驗豐富的介入心臟病學家進行評估。診斷標準依據中華醫學會心血管病分會制定的診斷標準，冠狀動脈至少一支主要分支管腔直徑狹窄在50%以上［7］。排除標準：（1）合并其他心臟疾病；（2）既往接受靜脈溶栓、冠狀動脈支架置入術或冠狀動脈旁路移植術的患者。對照組為同期本院體檢中心健康體檢的無冠心病的人群，共納入160 例。所有受試者均被排除在糖尿病、嚴重感染、嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤及藥物濫用史，相互之間無親緣關系。采用問卷調查法收集受試者的基礎臨床信息。

1.2 標本采集 所有受試者均于空腹12 h 后于次日清晨抽取4 mL 正中靜脈血，分兩管置于EDTA抗凝管中，其中一管抗凝血送檢驗科，用于丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）檢測；另一管抗凝管置于-80 ℃冰箱中保存，以備DNA 的提取，用于基因型的檢測。同時對受試者性別、年齡、身高等基本信息進行統計，計算體質量指數（BMI）= 體質量（kg）/身高（m）2［8］。本研究未記錄包括運動和飲食情況在內的環境因素。

1.3 DNA 提取及基因型檢測 采用血液基因組DNA 提取試劑盒（百泰克生物技術有限公司，北京）進行全血基因組DNA 提取，提取的基因組DNA存放于-20 ℃冰箱備用。采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法進行PNPLA3目的基因的擴增，檢測基因型。PCR 引物由北京博淼生物科技設計合成，具體引物序列為：上游引物：5′-ACGTTGGATGCCCCTCTTATCTCTGTTTCG-3′下游引物：5′-ACGTTGGATGCAGTGTCACTTCATTTAGCC-3′。引物濃度均為10 μmol/L，-20 ℃冰箱保存。PCR 擴增程序為：首先94 ℃預變性30 s，然后進行40 個循環的擴增反應，每個擴增反應的程序為94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s。循環結束后保持72 ℃運行3 s，后降至4 ℃保存。對所得到的PCR 產物進行去磷酸化處理，然后進行目的序列的單堿基延伸反應，對所得產物進行質譜分型鑒定，檢測結果使用TYPER 4.0 軟件獲取原始數據。

1.4 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件對所得數據進行統計分析。采用χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡法則，以確認樣本的群體代表性。采用χ2檢驗分析兩組間性別、基因型及等位基因頻率的差異性。符合正態分布的計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的用中位數（最小值～最大值）表示，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。基因多態性與冠心病發生的相對風險度以比值比（OR）及其95%置信區間（95%CI）表示，應用非條件Logistic 回歸模型計算OR及95%CI。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 冠心病組共納入199 例患者，其中男112 例，女87 例；健康對照組共納入160 例，其中男74 例，女86 例。兩組研究對象性別比例的差異無統計學意義（P＞0.05）。冠心病組患者的年齡、體質量、BMI、Glu、ALT、γ-GGT、ALP 和TBIL水平顯著高于健康對照組，HDL 水平顯著低于健康對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的頻率分布 在冠心病組和對照組均檢出CC、CG、GG3種基因型，兩組rs738409 基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（冠心病組χ2=0.210，P=0.647，對照組χ2=0.001，P=0.971），具有群體代表性。兩組間基因型及等位基因的分布頻率的差異均無統計學意義（均P＞0.05，表2）。非條件Logistic 回歸模型分析顯示：CG 、GG 基因型攜帶者分別與CC 基因型攜帶者相比較，二者差異均無統計學意義（均P＞0.05）。CG + CG 攜帶者與CC 攜帶者相比，發病風險未增加（OR=1.037，95%CI：0.683～1.575，P=0.865）；調整年齡、性別、BMI 后，差異仍無統計學意義（校正OR=1.127，95%CI：0.640～1.986，P=0.678）。G 等位基因的攜帶者對比C 等位基因攜帶者，所得結果差異無統計學意義（P＞0.05），在調整年齡、性別及BMI 的影響后，結果仍無改變（P＞0.05，表3）。

2.3 不同組內突變等位基因非攜帶者與攜帶者之間臨床特征的比較 在冠心病組、健康對照組的各自組內比較中，PNPLA3 rs738409 G 等位基因的攜帶者與非攜帶者之間年齡、性別、BMI、Glu、TG、TC、HDL、LDL、ALT、AST、γ-GGT、ALP 及TBIL 指標比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表4。

表1 冠心病組和對照組一般臨床資料比較Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

表1 冠心病組和對照組一般臨床資料比較Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

注：BMI，體質量指數；Glu，血糖；TG，甘油三酯；TC，總膽固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；ALT，丙氨酸氨基轉移酶；AST，天門冬氨酸氨基轉移酶；γ-GGT，谷氨酰轉肽酶；ALP，堿性磷酸酶；TBIL，總膽紅素

t/χ2/Z 值15.220 3.575 1.464 2.716 2.568-6.632-1.955 1.475-7.765 1.687-3.654-1.823-4.357-4.078-2.070 P 值＜0.001 0.059 0.144 0.007 0.011＜0.001 0.051 0.141＜0.001 0.093＜0.001 0.068＜0.001＜0.001 0.038指標年齡（歲）男/女（例）身高（cm）體質量（kg）BMI（kg/m2）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）γ-GGT（U/L）ALP（U/L）TBIL（μmol/L）冠心病組（n=199）67.35±11.56 112/87 168.49±6.34 69.84±10.58 24.61±3.29 5.24（2.28～18.33）1.36（0.05～6.09）4.57±1.32 1.00（0.35～1.83）2.78±1.08 21.95（5.70～156.66）21.82（10.13～223.90）27.50（9.47～171.78）81.42（28.72～194.44）13.40（2.50～63.90）對照組（n=160）48.21±12.19 74/86 167.34±8.13 66.61±11.86 23.70±3.39 4.56（2.92～17.08）1.18（0.41～6.67）4.37±1.12 1.28（0.50～3.60）2.62±0.59 18.23（6.49～236.13）20.46（10.94～150.43）19.61（7.52～374.46）69.65（30.70～182.29）12.05（3.90～29.20）

表2 冠心病組和對照組PNPLA3 rs738409 基因型和等位基因的分布Tab.2 Distributions of the PNPLA3 rs738409 genotype and allele in CAD and control groups 例（%）

3 討論

冠心病是心血管病中首要危險因素，其發病率及病死率逐年上升。PNPLA3 是調節TG 代謝的重要因子，大量證據表明TG 與罹患冠心病風險呈正相關，降低TG 水平可降低冠心病發生風險［9］。本研究采用病例對照的研究方法，對PNPLA3基因多態性與冠心病的相關性進行探討。本研究結果顯示PNPLA3 rs738409 位點多態性與冠心病發病風險無顯著相關性，調整混雜因素后，差異仍無統計學意義。該結果與此前墨西哥一項針對PNPLA3 基因多態性與冠心病相關性的研究結果相一致［10］。PETTA 等［11］發現在攜帶PNPLA3 rs738409 GG 基因型的NAFLD 患者發生頸動脈粥樣硬化的風險增高。另有一項歐洲大數據人群研究表明PNPLA3 rs738409 G 等位基因對冠心病有一定的保護作用［12］。該結論在德國人群中進一步得到證實，rs738409 G 等位基因與TC、LDL 水平呈負相關，與罹患冠心病的風險亦呈負相關［13］。

表3 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的發病風險Tab.3 Correlation of PNPLA3 rs738409 genotype and allele with the risk of CAD

既往有研究表明PNPLA3 與ALT 水平顯著相關，ALT 水平升高，心血管疾病患者病死率更高［14］。然而本研究PNPLA3 rs738409 G 等位基因非攜帶者與攜帶者在冠心病組、健康對照組的各自組內比較中，血脂、肝功能各項指標差異均無統計學意義。分析其原因可能為，本次研究對象僅限于青島地區人群，考慮到不同種族地區人群的遺傳背景差異較大，后續研究應在更多地區、更多人群中開展。

綜上所述，目前國外關于PNPLA3 rs738409 多態性與冠心病相關性的研究整體偏少，且所得結論不一。本研究為國內關于PNPLA3 與冠心病相關性的首次探討，但仍存在一定的不足。地域條件、樣本數量等條件限制，以及部分確診冠心病患者通過降脂藥物進行臨床干預，均可能在一定程度上影響了結果的準確性。盡管本研究所得結論是陰性的，但仍可為后續的研究提供參考。

表4 PNPLA3 rs738409 G 等位基因非攜帶者與攜帶者的臨床特征比較Tab.4 Analysis of clinical characteristics in PNPLA3 rs738409 G allele carriers and non-carriers of the study population x±s