TAM受體檢測(cè)評(píng)估COPD患者嚴(yán)重程度的研究

李富榮，樊瑞軍，鄧 麗

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中心，寧夏銀川 750002)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為主要特點(diǎn)的呼吸道疾病，近年來(lái)病死率顯著上升，在全球范圍內(nèi)居死亡原因的第4位[1]。COPD發(fā)生常伴自主呼吸功能差、咳嗽、哮喘等氣道炎性反應(yīng)及意識(shí)障礙、嗜睡等精神癥狀，且極易引發(fā)呼吸睡眠障礙、慢性呼吸衰竭、慢性肺源性心臟病和自發(fā)性氣胸等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[2]。既往研究顯示[3]，COPD發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。且病理學(xué)研究認(rèn)為[4-5]，COPD患者肺內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量隨巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞吞噬能力的減弱而大量增加，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞聚集于肺內(nèi)而不能及時(shí)清除，從而造成凋亡細(xì)胞繼發(fā)性壞死，致使機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)。目前，臨床上評(píng)估COPD嚴(yán)重程度的血漿標(biāo)志物較少，TAM受體是一個(gè)受體酪氨酸激酶(RPTKs)亞家族，Tyr03、Mer、Axl為其成員且結(jié)構(gòu)相似，具有共同的配體S蛋白與生長(zhǎng)停滯特異性蛋白6(Gas6)。作為吞噬凋亡細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)蛋白，TAM受體及其配體具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附及吞噬，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的生理功能，并在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KHAN等[6]采用動(dòng)物模型探討發(fā)現(xiàn)Tyr03、Mer、Axl基因敲除后AM/小鼠肺內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，發(fā)生自發(fā)性的自身免疫性肝炎，表明TAM受體為COPD凋亡清除過(guò)程中的血漿標(biāo)志物。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)COPD患者血漿中Tyr03、Mer、Axl水平，旨在探討COPD中TAM受體的表達(dá)與臨床意義，以期為臨床COPD治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2018年1月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科收治的468例COPD患者作為COPD組，根據(jù)COPD全球倡議(GOLD)將其分為Ⅰ期(n=31)、Ⅱ期(n=107)、Ⅲ期(n=176)、Ⅳ期(n=154)，另收集同期本院400例體檢健康者作為健康對(duì)照組。COPD組：男365例，女103例；年齡23～80歲，平均(70.28±9.37)歲。健康對(duì)照組：男294例，女106例；年齡25～82歲，平均(70.37±6.05)歲。COPD組與健康對(duì)照組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組第1秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)計(jì)值的百分比(FEV1%)與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COPD Ⅰ組 FEV1%與COPD Ⅱ組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COPD Ⅱ組、COPD Ⅲ組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)及COPD Ⅲ組FEV1%與COPD Ⅳ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；COPD Ⅱ組 FEV1%與COPD Ⅲ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病分會(huì)COPD學(xué)組2013年制訂的COPD診治指南[6]；(2)未合并混合性結(jié)締組織病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、急性特發(fā)性多神經(jīng)炎；(3)本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)入選患者均簽署知情同意書(shū)；(4)患者住院資料詳細(xì)；(5)心、肝、腎功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并肺結(jié)核、肺間質(zhì)病、支氣管擴(kuò)張等其他肺部疾病；(2)合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、硬皮病、甲狀腺自身免疫病等自身免疫性疾病；(3)患者對(duì)本次研究有異議；(4)妊娠或哺乳期婦女；(5)合并嚴(yán)重精神病或心血管、造血系統(tǒng)疾病；(6)合并惡性腫瘤疾病。

表1 兩組一般資料比較

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.05；與COLD Ⅱ期比較，bP<0.05；與COLD Ⅳ期比較，cP<0.05；與COLD Ⅲ期比較，dP<0.05

1.2方法 (1)入院后抽取所有研究對(duì)象晨起空腹靜脈血4 mL，1 000×g離心10 min，收集血漿于-80 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)COPD組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)及健康對(duì)照組血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平。ELISA具體步驟如下：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后各孔加入待測(cè)樣品50 μL，37 ℃溫育30 min。洗滌緩沖液洗滌5次，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，37 ℃溫育30 min。洗滌緩沖液洗滌5次，先后加入顯色劑A 50 μL、顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)后15 min內(nèi)以空白空調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A值)。主要儀器試劑：碳酸鹽包被緩沖液購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；檸檬酸購(gòu)自山東恒通生物科技公司；37 ℃孵育箱購(gòu)自迪測(cè)生物科技有限公司；酶標(biāo)板購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；移液槍購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；洗滌緩沖液購(gòu)自連云港端峰生物科技有限公司；牛血清清蛋白購(gòu)自上海西寶生物科技股份有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自湖北卓奧環(huán)保科技有限公司；98%濃硫酸購(gòu)自廣州市御和田化工科技有限公司。(2)分析COPD患者血漿中sAxl、sMer、sTyr03與臨床指標(biāo)的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1COPD組與健康對(duì)照組血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平 COPD組血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平顯著低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2COPD組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平 COPD組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血漿中sTyr03水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；COPD組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血漿中sAxl、sMer水平依次下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 COPD組與健康對(duì)照組血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平比較

注：與健康對(duì)照組比較，aP<0.05

2.3COPD患者血漿中sAxl、sMer、sTyr03與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析 血漿sAxl與COPD患者年齡、FEV1/FVC、BMI、FEV1%呈正相關(guān)關(guān)系，血漿sMer、sTyr03與患者FEV1%呈正相關(guān)關(guān)系。見(jiàn)表4、圖1。

2.4COPD危險(xiǎn)因素的Logistics回歸分析 Logistics回歸分析結(jié)果顯示，COPD分期、sAxl、sTyr03、sMer為COPD的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表5。

表3 COPD組各期血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平比較

注：與COPD Ⅰ期比較，aP<0.05；與COLD Ⅱ期比較，bP<0.05；與COPD Ⅲ期比較，cP<0.05

表4 COPD患者血漿中sAxl、sMer、sTyr03與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析P值

注：A為sAxl；B為sMer；C為sTyro3水平

圖1 sAxl、sMer和sTyro3水平與COPD患者相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，TAM受體缺失的小鼠患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)等自身免疫病及慢性炎癥，這與TAM受體信號(hào)通路介導(dǎo)的抑制天然免疫、清除凋亡細(xì)胞等密切相關(guān)。眾所周知，COPD為一種呈進(jìn)行性發(fā)展的慢性呼吸道疾病，其確切病因尚不清楚，以往研究報(bào)道其與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎性反應(yīng)有關(guān)[8-10]。近期相關(guān)研究也報(bào)道[11]，免疫球蛋白A(IGA)、抗核抗體(ANA)、免疫球蛋白G(IGG)、抗肺上皮細(xì)胞抗體(AECA)、免疫球蛋白M(IGM)等多種自身抗體廣泛參與COPD發(fā)病及病情進(jìn)展，且COPD患者自身抗體在GOLD Ⅲ期和GOLD Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)率更高，進(jìn)一步證實(shí)COPD發(fā)病及進(jìn)展與自身免疫有關(guān)，且凋亡細(xì)胞清除不足現(xiàn)象常存在于自身免疫機(jī)制的形成過(guò)程中。

Tyr03、Mer、Axl具有調(diào)控免疫細(xì)胞分化、清除凋亡細(xì)胞的重要功能[12]，與其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符[6-7]。血漿分泌型可溶性蛋白Mer、Tyr03、Axl與氨基端Gla域結(jié)合凋亡細(xì)胞膜上外翻的磷酯酰絲氨酸，可促進(jìn)TAM受體的配體Gas6羧基端與單核吞噬細(xì)胞表面TAM受體結(jié)合，以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬清除凋亡細(xì)胞。相關(guān)研究報(bào)道，COPD患者肺內(nèi)凋亡細(xì)胞的大量增加使凋亡細(xì)胞不能被徹底清除，造成凋亡細(xì)胞繼發(fā)性壞死，最終導(dǎo)致炎癥發(fā)生[13-15]。因此，推測(cè)異常的TAM受體信號(hào)傳導(dǎo)可能參與COPD發(fā)病過(guò)程。TAM受體在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)、原發(fā)性干燥綜合征(PSS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)等不同疾病中作用已經(jīng)有相關(guān)研究。劉磊[16]發(fā)現(xiàn)S蛋白在SLE患者血漿中的水平顯著下降，Gas6在SLE患者血漿中的水平則顯著升高，且SLE患者Gas6與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)(SLEDAI)呈顯著負(fù)相關(guān)，而SLE患者S蛋白與SLEDAI無(wú)明顯相關(guān)性。楊云嬌等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PSS患者Axl在信使RNA水平上顯著低于健康對(duì)照者，PSS患者sMer在血漿水平上顯著高于健康對(duì)照組，且sMer與PSS患者血漿IgG呈正相關(guān)。吳俊等[18]對(duì)ACS患者實(shí)施冠狀動(dòng)脈介入手術(shù)，發(fā)現(xiàn)ACS患者sMer、sTyr03水平均顯著高于健康者，且ACS患者sMer與sTyr03呈正相關(guān)，提示sMer與sTyr03可能由豐富表達(dá)sMer、sTyr03受體的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，且Mer可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞，Mer受體缺失可能導(dǎo)致凋亡細(xì)胞聚集于肺內(nèi)而不能及時(shí)清除，從而加速動(dòng)脈粥樣化(AS) 。

本研究以本院收治的468例COPD患者為研究對(duì)象，將其與400例健康對(duì)照者對(duì)比發(fā)現(xiàn)，健康對(duì)照組血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平明顯高于COPD組，這與其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本吻合[16-18]，提示sAxl、sTyr03、sMer在COPD發(fā)病過(guò)程中發(fā)生明顯變化。同時(shí)，檢測(cè)COPD 患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血漿中sAxl、sTyr03、sMer水平，發(fā)現(xiàn)COPD患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血漿中sTyr03水平無(wú)明顯差異，且COPD組患者血漿中sAxl、sMer水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期依次顯著性下降。分析其原因可能是隨著COPD病情加重，大量凋亡細(xì)胞在COPD患者肺內(nèi)聚集，結(jié)合凋亡細(xì)胞消耗過(guò)多，導(dǎo)致sAxl、sMer水平降低，提示sAxl、sMer可用于評(píng)估COPD嚴(yán)重程度。隨后，分析COPD患者血漿中sAxl、sMer、sTyr03與臨床指標(biāo)的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，血漿sAxl與COPD患者年齡、FEV1/FVC、BMI、FEV1%呈正相關(guān)關(guān)系，血漿sMer、sTyr03與患者FEV1%呈正相關(guān)關(guān)系。COPD病情越嚴(yán)重，sAxl、BMI越低，這與COPD患者Ⅳ期BMI顯著低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期相符。為進(jìn)一步探究sAxl、sTyr03、sMer在COPD中的檢測(cè)意義，采用Logistic回歸分析COPD危險(xiǎn)因素時(shí)發(fā)現(xiàn)COPD分期、sAxl、sTyr03、sMer為COPD的危險(xiǎn)因素。

4 結(jié) 論

綜上所述，sAxl、sMer、sTyr03在COPD患者血漿中明顯降低，且sAxl、sMer水平與COPD嚴(yán)重程度密切相關(guān)，sAxl、sMer TAM受體可作為評(píng)估COPD患者嚴(yán)重程度的標(biāo)志物。但本研究為單中心小樣本研究，仍需多中心大樣本研究加以證實(shí)。