紙片擴散法和微量肉湯稀釋法檢測念珠菌氟康唑和伏立康唑藥物敏感性的比較*

張 麗，王 賀，肖 盟，徐英春△

(1.中國醫學科學院北京協和醫院檢驗科，北京 100730；2.侵襲性真菌病機制研究與精準診斷北京市重點實驗室，北京 100730)

隨著糖皮質激素和免疫抑制劑的廣泛使用、HIV感染的流行以及器官移植的開展等因素，侵襲性真菌感染的發病率在逐年增加，給患者的預后和生命安全帶來很大的威脅。其中念珠菌的感染尤為引人關注[1-3]。目前，念珠菌血癥已占醫院血源性感染的8%～10%，排在院內感染性疾病的第4位，念珠菌血癥的總體病死率高達40%[4-5]。感染早期選擇合適的抗真菌藥物對提高患者生存率至關重要[6]。不同地區和種屬的念珠菌對于不同類型抗真菌藥物敏感性存在差異，并且近年來隨著抗真菌藥物廣泛預防性使用，念珠菌耐藥菌株也在不斷出現[7]。臨床實驗室積極開展抗真菌藥物體外敏感性檢測及參與真菌耐藥監測項目，對臨床合理使用抗真菌藥物具有重要的指導意義。

目前，真菌體外藥物敏感性的檢測方法有多種，包括微量肉湯稀釋法、紙片擴散法及多種商品化試劑盒，如ATB fungus 3和Etest試條等，其中美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法為金標準，但操作繁瑣，耗時耗力，限制了其在臨床中的應用[8]。CLSI M44規范了紙片擴散法在測試真菌藥物敏感性中的應用，是簡便、節約成本的方法，尤其適用于大規模真菌耐藥監測[9]。目前，國內外基于侵襲性感染念珠菌菌株藥物敏感方法學評價較少，并且評估均基于紙片擴散法CLSI M44-S3和微量肉湯稀釋法CLSI M27-S4規定的折點[10-11]。而2018年頒布的CLSI M60按照不同種念珠菌更新了種特異性折點，因此，本研究的主要目的是利用全國多中心分離的侵襲性真菌感染念珠菌，依據CLSI M60評價紙片擴散法測試念珠菌氟康唑和伏立康唑藥物敏感性與微量肉湯稀釋法的一致性[12]。

1 材料與方法

1.1菌株來源 218株來源于侵襲性真菌耐藥監測網(CHIF-NET10)的念珠菌納入評估研究，菌株分離自10家醫院的深部真菌感染患者。其中白念珠菌81株，熱帶念珠菌41株，近平滑念珠菌38株，光滑念珠菌42株和克柔念珠菌16株。

1.2質控菌株 紙片擴散法和微量肉湯稀釋法使用的質控菌株均為ATCC22019近平滑念珠菌、ATCC90028白念珠菌和ATCC6528克柔念珠菌[8-9]。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定 所有菌株經科馬嘉顯色培養基傳代培養進行初步鑒定，后采用rRNA內轉錄間隔區(ITS)序列測定的方法準確鑒定到種。

1.3.2紙片擴散法 紙片擴散法操作按照CLSI M44-A2文件測定氟康唑、伏立康唑的藥物敏感性[9]。在藥物敏感培養基上分別貼氟康唑(25 μg)及伏立康唑(1 μg)藥物敏感紙片，35 ℃ 孵育24 h。 紙片擴散法的判定折點參考CLSI M60，具體如下，白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌，氟康唑：敏感≥17 mm,劑量依賴性敏感14～16 mm,耐藥≤13 mm；伏立康唑：敏感≥17 mm,中介15～16 mm,耐藥≤14 mm。光滑念珠菌，氟康唑：劑量依賴性敏感≥15 mm，耐藥≤14 mm。克柔念珠菌，伏立康唑：敏感≥15 mm，中介13～14 mm，耐藥≤12 mm[12]。

1.3.3微量肉湯稀釋法 微量肉湯稀釋法嚴格按照CLSI M27操作，抗真菌藥物濃度范圍：氟康唑0.125～64.000 μg/mL，伏立康唑0.030～16.000 μg/mL[8]。藥物敏感結果判定：根據CLSI M60進行判定，對于白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌，氟康唑：敏感≤2.000 μg/mL,劑量依賴性敏感4.000 μg/mL,耐藥≥8.000 μg/mL；伏立康唑：敏感≤0.120 μg/mL,中介0.250～0.500 μg/mL,耐藥≥1.000 μg/mL。光滑念珠菌，氟康唑：劑量依賴性敏感≤32.000 μg/mL，耐藥≥64.000 μg/mL。克柔念珠菌，伏立康唑：敏感≤0.500 μg/mL，劑量依賴懷敏感1.000 μg/mL，耐藥≥2.000 μg/mL[12]。

1.4統計學處理 統計微量肉湯稀釋法和紙片擴散法2種方法分類一致率，一致率指的是微量肉湯稀釋法和紙片擴散法的判定結果一致(均為敏感、中介或耐藥)的菌株占總測定株數的比率。顯著錯誤，即微量肉湯稀釋法為耐藥，紙片擴散法敏感；大錯誤，即微量肉湯稀釋法為敏感，紙片擴散法測試為耐藥；小錯誤，即其中一種方法為中介或劑量依賴性敏感，另外一種方法測試結果為敏感或耐藥。

2 結 果

2.1紙片擴散法和微量肉湯稀釋法的質控菌株結果均在控，測試菌株的總體比較結果見表1。

表1 218株念珠菌對氟康唑和伏立康唑的微量肉湯稀釋法和紙片擴散法藥物敏感結果[n(%)]

續表1 218株念珠菌對氟康唑和伏立康唑的微量肉湯稀釋法和紙片擴散法藥物敏感結果[n(%)]

2.22種藥物敏感方法檢測氟康唑的一致率 2種方法檢測白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌氟康唑藥物敏感性的一致率分別為97.6%、95.1%、97.4%和90.5%，克柔念珠菌無氟康唑判定折點無法統計。白念珠菌中有1株耐藥株(8.000 μg/mL)紙片擴散法測試為敏感(22 mm)，另有1株耐藥菌(16.000 μg/mL)紙片擴散法測定為中介(14 mm)。1株近平滑念珠菌氟康唑中介株(4.000 μg/mL)紙片擴散法測定為敏感(23 mm)。2株熱帶念珠菌中介株紙片擴散法檢測為敏感。2株光滑念珠菌劑量依賴性敏感株檢測為耐藥，2株耐藥株檢測為劑量依賴性敏感。白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌具體檢測的氟康唑紙片直徑和最低抑菌濃度(MIC)值對應關系散點圖見圖1。

圖1 白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌氟康唑紙片直徑和MIC值比較散點圖

2.32種方法檢測伏立康唑的一致率 2種方法檢測白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌伏立康唑藥物敏感性的一致率分別為97.6%、90.2%、97.4%和81.2%。白念珠菌中有1株耐藥株(1.000 μg/mL)紙片擴散法測試為敏感(22 mm)，另有1株中介菌(0.500 μg/mL)紙片擴散法測定為敏感(20 mm)。1株近平滑念珠菌氟康唑耐藥株(1.000 μg/mL)紙片擴散法測定為敏感(20 mm)。3株熱帶念珠菌中介株紙片擴散法測定為敏感，1株中介株紙片擴散法測定為耐藥。1株克柔念珠菌敏感株(0.250 μg/mL)紙片擴散法檢測為中介(14 mm)，1株中介株(1.000 μg/mL)紙片擴散法檢測為敏感(18 mm)，1株中介株(0.500 μg/mL)紙片擴散法檢測為耐藥(10 mm)。白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌伏立康唑具體檢測紙片直徑和MIC值對應關系散點圖見圖2。

圖2 白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌伏立康唑紙片直徑和MIC值比較散點圖

3 討 論

隨著念珠菌感染患者逐年增多，抗真菌藥物尤其是氟康唑和伏立康唑作為臨床治療真菌感染的常見藥物，被廣泛應用于臨床，但近年來出現對唑類藥物不敏感的菌株[13]。臨床實驗室真菌藥物敏感性試驗對于指導臨床治療具有重要價值。另外，真菌耐藥監測網檢測真菌整體耐藥性為了解真菌耐藥性的改變及經驗使用抗真菌藥物提供重要數據支撐[14]。紙片擴散法是檢測念珠菌藥物敏感性較為簡便低成本的方法，其與微量肉湯稀釋法的一致性既往有相關評價，是基于CLSI M44制訂的折點或其他參考文獻進行的分類一致率評價[15-18]。2018年新頒布的CLSI M60文件對不同念珠菌制訂了種特異性折點，因此，本研究主要基于全國多中心收集的侵襲性感染念珠菌，依據CLSI M60更新的種特異性折點進行2種檢測方法測試氟康唑和伏立康唑一致性的比較。

本評估結果顯示，除克柔念珠菌對伏立康唑、光滑念珠菌對氟康唑的一致性稍低，其余藥物菌株組合的一致性均超過95.0%。僅3個藥物菌種組合出現顯著錯誤，其余16個藥物菌種組合均為小錯誤，無大錯誤出現。光滑念珠菌對氟康唑的2種方法藥物敏感結果一致率偏低，這在既往研究中也有報道，如PFALLER等[15]使用舊折點評估紙片擴散法中，光滑念珠菌對氟康唑一致率為71.7%，明顯低于白念珠菌(99.6%)、熱帶念珠菌(97.9%)和近平滑念珠菌(93.3%)。而本研究中雖然光滑念珠菌對氟康唑的一致率低于其他種，但也高達90.5%，這與光滑念珠菌紙片擴散法新折點與微量肉湯稀釋法二者相關性更高有關。另外，本研究中克柔念珠菌對伏立康唑的敏感性在2種方法中的一致率偏低，這在既往研究中報道較少。

本研究基于最新CLSI M60文件規范的紙片擴散法折點進行評估結果顯示，紙片擴散法與微量肉湯稀釋法一致率較高，結果可靠。全球侵襲性耐藥監測網如ARTEMIS和中國侵襲性真菌耐藥監測網(CHIF-NET)均采用紙片擴散法測試真菌藥物敏感性[7,14,19]。CHIF-NET連續5年多中心的數據顯示白念珠菌氟康唑耐藥率為0.5%，與ARTEMIS結果相近(1.4%)[4,19]。而國內單中心報道普遍偏高，如在某醫院報道中白念珠菌對氟康唑的耐藥率高達59.8%，顯著高于真菌耐藥監測網整體水平，推測可能是實驗人員藥物敏感讀數偏大，尤其是念珠菌藥物敏感的拖尾現象容易導致人員將敏感菌株判定為耐藥[20]。紙片擴散法藥物敏感試驗中唑類藥物須以菌落生長明顯抑制處為測量邊界，忽略邊緣小菌落或抑菌環內生長的菌落。因此，紙片擴散法測試結果的正確讀取是報告準確真菌敏感性結果的重要保證。

4 結 論

紙片擴散法藥物敏感試驗方法在真菌藥物敏感檢測中，因操作方便、成本較低、結果與微量肉湯稀釋法一致率高，易于在臨床真菌實驗室開展，也可作為真菌耐藥監測的重要方法。但需要注意的是，讀取藥物敏感結果人員需要進行培訓，避免將敏感結果判定為耐藥。