云南省臨滄地區2009-2014年HIV-1基因型耐藥情況分析*

鐘 敏，段 勇，何增品，李 婭，左薇薇，楊恒根

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科，云南昆明 650032；2.云南省實驗診斷研究所，云南昆明 650032；3.云南省檢驗醫學重點實驗室，云南昆明 650032；4.臨滄市人民醫院醫學檢驗科，云南臨滄 677000)

國家艾滋病(AIDS)免費抗病毒治療工作在全國深入開展,針對AIDS病毒耐藥的研究也長期持續展開，這為了解我國免費抗病毒治療后人類免疫缺陷病毒(HIV)耐藥毒株的發生與流行情況提供了寶貴的資料。目前，臨滄是云南省AIDS流行地區之一，截至2014年底，臨滄地區累計存活HIV感染者和AIDS患者6 970例,占整個地區總人口的0.29%。為進一步加強臨滄地區AIDS的防控工作,本研究對2009年1月1日至2014年12月31日整個臨滄地區1 935例經過高效抗逆轉錄病毒治療(HAART)后病毒學失敗的AIDS患者進行橫斷面調查,分析這些病毒學失敗人群中耐藥突變發生情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009-2014年云南省臨滄地區接受免費HAART的HIV感染/AIDS患者的治療信息，篩選出其中抗病毒治療時間≥6個月、病毒載量≥1 000拷貝/mL的患者的血漿標本進行HIV-1耐藥檢測[1]。同時，收集HIV感染/AIDS患者的人口學、臨床及實驗室資料。上述血漿樣本保存于-80 ℃低溫冰箱，未經過反復凍融。

1.2儀器與試劑

1.2.1血漿RNA提取 采用德國Qiagen公司QIAamp Viral RNAMini Kit試劑盒，從待檢血漿中抽提病毒RNA，具體操作見試劑盒說明書。

1.2.2基因型耐藥性檢測 提取的RNA經逆轉錄后，用RT-PCR完成對樣本靶基因的擴增，即先用一步RT-PCR方法完成逆轉錄和第1輪PCR，使用大連寶生物公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，再以第1輪PCR產物為模板進行第2輪PCR。耐藥檢測使用引物見表1，耐藥檢測反應體系及程序參照文獻[2]。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，采用德國Qiagen公司Qi Aamp Gel Extraction Kit 進行回收，回收片段委托北京諾賽基因有限公司進行序列測定。所使用的方法擴增產物長度為1 170 bp，包括蛋白酶基因全長(1～99氨基酸)和逆轉錄酶基因至少前254個氨基酸(1～254氨基酸)。

表1 基因型耐藥性檢測及測序引物序列

注：a為測序引物；HXB2為標準參考株

1.3方法 序列拼接與耐藥分析：耐藥分析應用Contig Express軟件拼接原始核苷酸序列，用Bio Edit軟件進行拼接后序列的校對、整理和比對分析，整理后序列提交斯坦福HIV藥物抗性數據庫(Stanford HIV Drug Resistance Database，http://hivdb.stanford.edu)進行耐藥突變位點的分析和解釋耐藥變異情況。

1.4統計學處理 應用SPSS22.0軟件對所得到的HIV-1耐藥基因突變頻率和位點進行統計，計數資料以頻數或百分比表示。

2 結 果

2.1研究對象特征 收集2009-2014年云南省臨滄地區接受國家免費HAART患者病毒學失敗血漿標本共1 935例，其中男性1 156例，女性779例，性別比例為1.5∶1，年齡2～87歲，平均年齡(39.15±9.95)歲。確認時間在2003-2014年，接受HAART的治療時間為7～105個月，平均治療時間為35.62個月。病毒載量1 000～487 498拷貝/mL,平均值為(46 782±148) 拷貝/mL。感染方式：性傳播1 507例(占77.9%)，靜脈藥癮傳播362例(占18.7%)，母嬰傳播8例(占0.4%)，輸血傳播17例(占0.9%)，其他不詳途徑傳播41例(占2.1%)。使用藥物方案均為國家免費AIDS抗病毒藥物治療手冊推薦的方案[3]。見表2。

表2 1 935例患者的臨床資料

續表2 1 935例患者的臨床資料

注：AZT為齊多夫定；D4T為司他夫定；3TC為拉米夫定；NVP為奈韋拉平；EFV為依非韋侖；LPV/r為洛匹那韋/利托那韋；ABC為阿巴卡韋

2.2基因型耐藥突變位點情況 共894例患者檢測出與耐藥相關的突變位點，占抗病毒治療病毒學失敗患者的46.2%(894/1 935)，占抗病毒治療總體人群的6.6%(894/13 491)。1 935例檢測結果中，與蛋白酶類抑制劑(PIs)相關的主要耐藥基因突變位點L33F 15例，占0.8%(15/1 935)；與核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)相關的突變中，突變位點發生頻率最高的是M184V/I，占23.2%(451/1 935)。與非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)相關的突變中，突變位點發生頻率最高的是K103N/S，占19.5%(377/1 935)，其他依次為G190A/S，占7.9%(153/1 935)；Y181C/V，占8.1%(157/1 935)；V179D/E，占7.9%(153/1 935)。見表3。

表3 894例患者耐藥突變位點情況

2.3HAART后藥物耐藥情況 1 935例HAART后病毒學失敗患者中，894例患者檢測出耐藥突變，在使用的NNRTIs藥物中對NVP、EFV高度耐藥的構成比分別為34.5%、27.1%；核苷類藥物中對3TC、AZT、D4T、TDF高度耐藥的構成比分別為23.5%、3.5%、3.5%、1.6%，對LPV/r高度耐藥的構成比為0.8%。見圖1。

2.4各治療時間耐藥突變分析 各治療時間的耐藥突變差異有統計學意義(χ2=108.423，P<0.01),并且隨著治療時間延長,耐藥突變有增加的趨勢。所有組從治療6～12個月開始患者已表現出對NRTIs和(或)NNRTIs耐藥,并且從治療49～60個月開始患者對NNRTIs的耐藥突變率均超過了50.0%。見表4。

注：ATV/r為阿扎那韋/利托那韋；DRV/r為達蘆那韋/利托那韋；FPV/r為福沙那韋/利托那韋；IDV/r為茚地那韋/利托那韋；NFV為奈非那韋；SQV/r為沙奎那韋/利托那韋；TPV/r為替普那韋/利托那韋；DDI為去羥肌苷；FTC為恩曲他濱；TDF為替諾福韋；DLV為地拉夫定；ETR為依曲韋林

圖11395例患者藥物耐藥情況

3 討 論

截至2014年底，云南省臨滄地區自2005年實施免費抗病毒治療以來，整個地區有11家縣級及縣級以上醫院開展了AIDS抗病毒治療工作，隨著HAART的廣泛使用，顯著降低了HIV感染者相關疾病的發病率及病死率，提高了HIV感染者生存質量。抗病毒治療能夠有效恢復患者的免疫功能，但治療中存在一些問題，特別是耐藥問題，給深入開展HAART帶來嚴峻挑戰[3]。WHO推薦對抗病毒治療患者實施耐藥性監測以提高治療效果[4]。

本研究結果顯示,在平均治療35個月后，抗病毒治療病毒學失敗的894例患者產生不同程度的耐藥，治療人群的總耐藥率為6.6%,病毒學失敗人群的耐藥率達46.2%。目前，使用的抗病毒治療方案仍然以2種核苷類抑制劑和1種非核苷類抑制劑為主[5]，核苷類藥物是較易使患者產生多重耐藥突變從而導致針對多種核苷類藥物發生耐藥的藥物[6-7]。本研究中耐藥突變頻率較高的是NNRTI(50.6%)和NRTI(32.8%)類耐藥，其中NNRTI類耐藥突變率與總突變率(46.2%)相近，這與目前使用的一線治療方案相符。NRTI和NNRTI突變頻率最高的位點分別為M184V/I(23.2%)和 K103N/S(19.5%)，與國內其他研究結果一致[8-10]。眾所周知,AIDS患者服藥依從性的好壞直接影響治療效果,依從性差的患者不僅達不到有效的治療效果,還易產生耐藥毒株，這與國內其他HAART治療研究結果相一致[11-13]。本研究中的治療人群由于地處偏遠地區，文化教育程度不高，服藥依從性差成為耐藥產生的主要原因，在這些治療人群中有4.0%的患者甚至停藥。由于患者體內HIV出現耐藥性突變,導致抗病毒藥物無法完全抑制體內病毒的復制,而使患者的免疫功能即使在抗病毒治療實施以后仍然繼續遭受破壞,難以取得良好的治療效果。因此，為達到完全抑制病毒復制的目的,首先必須加強依從性教育,保證良好的服藥依從性,以取得預期的抗病毒效果,使免疫功能逐漸得以恢復、重建。其重要性在對患者的隨訪中已觀察到,且隨著治療時間延長,服藥依從性教育仍需要反復強調。

隨著抗病毒治療的開展以及治療時間的延長,由于患者的服藥依從性差導致的治療失敗以及隨著治療時間延長,耐藥性突變累積的現象有所增加,突變的種類及數量也逐漸增加,出現對現有各類一線藥物不同程度的耐藥[14-15]。在不同種類和強度的藥物選擇壓力下,HIV-1耐藥隨著治療時間逐漸增強,病毒準種的組成和分布始終處于動態變化中。從表4可以看出，臨滄地區2009-2014年接受抗病毒治療病毒學失敗人群耐藥率隨治療時間的延長呈上升趨勢。因此，隨著治療時間的延長，基因耐藥突變逐步累積導致耐藥率逐漸增高。

4 結 論

臨滄地區目前AIDS抗病毒治療病毒學失敗人群耐藥基因突變率較高，接受治療者對逆轉錄酶抑制劑的耐藥率較高，雖然基因型耐藥突變并不能表明所耐受的藥物已經失去作用,但是隨著治療時間的延長和耐藥突變的積累,抗病毒藥物最終將失去作用。隨著HAART治療的深入開展，應做好HAART過程中患者服藥的管理工作,提高患者的服藥依從性并及時進行耐藥監測，為抗病毒藥物合理選擇提供建議,減緩耐藥病例的發生，最終提高患者的生存質量。